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要約

この記事では、人工多能性幹細胞(iPSC)由来の肺上皮、間葉、内皮細胞、およびマクロファージで構成される複雑な多細胞気道バリアモデルを気液界面培養で生成する方法について説明します。

要約

ヒトの肺組織は、上皮、間葉、内皮、および鼻咽頭の上気道から最小の肺胞嚢までの免疫細胞の相互接続されたネットワークで構成されています。これらの細胞間の相互作用は、肺の発達や病気に不可欠であり、有害な化学物質や病原体に対するバリアとして機能します。現在の in vitro 共培養モデルは、異なる生物学的背景を持つ不死化細胞株を利用しているため、肺の細胞環境や相互作用を正確に表していない可能性があります。ヒトiPS細胞を3次元肺オルガノイド(上皮と間葉の両方を含む)、内皮細胞、マクロファージに分化させました。これらを気液界面(ALI)形式で共培養し、マクロファージを投入した上皮/間葉系頂端バリアと基底外側内皮バリア(iAirway)を形成しました。iPS細胞由来のiAirwaysは、呼吸器系ウイルスやタバコ毒素の感染に反応してバリアインテグリティの低下を示しました。この多系統肺共培養システムは、細胞間相互作用、シグナル伝達経路、および肺の発達、恒常性、および疾患の進行の根底にある分子メカニズムを研究するためのプラットフォームを提供します。iAirwayは、ヒトの生理機能や細胞間相互作用を密接に模倣しており、患者由来のiPS細胞から生成することができ、気道の異なる細胞タイプを含むようにカスタマイズすることができます。全体として、iPS細胞由来のiAirwayモデルは、疾患、病原体応答、免疫調節、in vitroでの創薬または転用のための遺伝的ドライバーをよりよく理解するためのバリアインテグリティを研究するための多用途で強力なツールを提供し、気道疾患の理解と治療を前進させる可能性を秘めています。

概要

大気道の血液-空気関門には、気管、気管支、細気管支が含まれます。呼吸器系の健康維持に重要な役割を果たし、気道上皮、基底膜、血管と内皮細胞、免疫細胞で構成されています。気道の主要な上皮細胞には、基底細胞、クラブ細胞、繊毛細胞、および杯細胞が含まれます。気道上皮の幹細胞として働く基底細胞は、高い増殖能と自己複製能を持つ多能性前駆細胞であり、成熟した気道上皮細胞を生じさせます1。クラブ細胞は、保護タンパク質と界面活性剤を分泌することにより気道内層の維持に寄与する非繊毛分泌細胞です2。内腔と粘膜下腺に位置する杯細胞は、ムチンを分泌して破片を捕捉し、気道を保護します3。繊毛細胞は粘液線毛エスカレーターのメカニズムに不可欠であり、有害な微生物の蓄積を防ぎます4。基底膜は細胞外マトリックスで構成されており、これが構造的な支持を提供します5。気管と気道の残りの部分は、血管の豊かなネットワークに囲まれており、内皮細胞が並んでおり、栄養素と酸素を供給し、老廃物を取り除き、炎症を調節し、組織修復と血管新生に寄与することにより、気管機能をサポートする重要な役割を果たします6。最後に、気道マクロファージは組織特異的な免疫細胞であり、呼吸器系を感染から保護し、吸入した粒子を除去し、バランスの取れた免疫応答を維持するために不可欠です7。

上皮細胞、間葉系細胞、内皮細胞、およびマクロファージ細胞の協調的な作用は、気道内の病原体に対する効果的な免疫応答にとって重要である8。上皮細胞は、物理的バリアとして機能することにより、ウイルス感染に対する防御の最前線を形成し、タイトジャンクションが有害物質の通過を制限します。繊毛細胞と杯細胞の協調的な作用は、吸入された粒子、病原体、および破片を捕捉して除去するのに役立ちます4。さらに、気道上皮細胞は、免疫細胞を動員するためのサイトカインとケモカインを産生します9。内皮細胞は血管の完全性を維持し、血流を介したウイルス粒子の拡散を防ぎ、免疫細胞の接着を促進するために接着分子(VCAM-1)をアップレギュレートし、血流から感染部位に免疫細胞を動員するための炎症誘発性サイトカインを産生する10。気道マクロファージは、ウイルス粒子、感染細胞、および破片を飲み込んで消化し、ウイルス抗原をT細胞に提示し、他の免疫細胞を活性化して動員するためのサイトカインを産生し、ウイルス複製を阻害するI型インターフェロンとともに11。上皮細胞、間葉系細胞、内皮細胞、およびマクロファージ細胞の協調的な作用により、ウイルス感染から気道を保護し、呼吸器の健康を維持する堅牢で動的な防御システムが作成されます。

ヒトの肺における様々な細胞タイプ間のダイナミックな相互作用を理解することは、ウイルス感染、炎症性疾患、および薬物送達に対する肺の応答を理解するために重要です。in vitro共培養により、上皮細胞、内皮細胞、および自然免疫細胞間の細胞間シグナル伝達の研究が可能になります12。私たちは、患者特異的なhiPSCに由来する最初の本格的なマルチセル型肺モデルを開発しました13。これには、上皮細胞集団と間葉系細胞集団の両方が組み込まれており、3D配向で形成されます。その後、肺前駆細胞を「気道オルガノイド」14に分化させ、無菌細胞培養インサート上で培養し、気液界面(ALI)に曝露して、ヒト気道15,16,17の状態を再現することができる。iPS細胞由来の内皮細胞は、基底膜の上皮/間葉系層の下に位置するヒト気道での配向を模倣して、膜の基底外側で培養されます。最後に、iPS細胞由来マクロファージを膜の頂端側に加え、上皮細胞と相互作用して活性化シグナルを待ちます(図1A)。このモデルは、気道の生物学と機能を正確に再現しています。私たちは、hiPSC 由来の患者特異的な真正多細胞型 iAirway 培養物が、気道バリアとウイルス感染を含む病原体の内因性急性応答を解明するのに最も適していると考えています。例えば、このモデルは、(1)ウイルスの侵入と複製の研究、(2)上皮および組織特異的免疫細胞による初期免疫応答の調査、(3)バリアの完全性と機能の調査、(4)治療薬の有効性の試験、(5)患者特異的モデルにおける病因の細胞および分子メカニズムの研究に使用できます。

この記事では、ウイルス感染に対する細胞応答を研究するために、多細胞肺共培養物を準備するための詳細なプロトコルについて説明します。

プロトコル

この研究プロトコルは、UCSD の Human Research Protections Program (181180) の治験審査委員会によって承認されました。このプロトコルは、低分子と成長因子を使用して、多能性幹細胞の気道細胞、内皮細胞、およびマクロファージへの分化を指示します。次に、これらの細胞を細胞培養インサート上で共培養し、気液界面で分極します。使用した試薬、消耗品、機器の詳細は 、材料表に記載されています。メディアおよびバッファ組成物は、 補足ファイル1に提供される。

1. iPS細胞由来気道オルガノイドの作製(1日目〜30日目)

注:このプロトコルは、Leibel et al.13に記載されている方法論に従って、iPSC由来の気道オルガノイド(図1B)を生成するために必要な手順を概説しています。このプロセスには、決定的内胚葉の誘導 (1 日目から 3 日目)、前腸内胚葉の生成 (4 日目から 6 日目)、および肺前駆細胞への分化 (7 日目から 16 日目) が含まれます。詳細な方法論は、以前の出版物13に記載されています。次の手順では、肺前駆細胞からの気道オルガノイドの生成について詳しく説明します。

  1. ECMポリマーからの肺前駆スフェロイドの抽出と解離(17日目)
    1. 細胞外マトリックス(ECM)ポリマー(8-9 mg / mL)を氷上で解凍します。
    2. ECMに埋め込まれた肺オルガノイドから、真空吸引器を使用して使用済み培地を吸引します。
      注意: その後の吸引ステップでは、特に明記されていない限り、真空吸引器を使用してください。
    3. 10 μMのROCK1阻害剤(ROCKi)を添加した2 U/mLディスパーゼ1 mLを細胞に加え、P1000ピペットを使用して肺前駆細胞をECMに手動で再懸濁します。37°Cで30分間インキュベートし、15分ごとに混合物を再懸濁して、機械的処理によるディスパーゼ解離効果を高めます。
    4. 使用の15分前に、室温のPBS45 mLを-20°Cの冷凍庫に入れて冷やします。PBSが4°Cより低温であることを確認して、次のステップで最適なECM解重合を行います。
    5. ディスパーゼインキュベーションの30分後、オルガノイドとディスパーゼ溶液を15 mLのコニカルチューブに移します。
    6. 冷却したPBS(プロテアーゼ1 mLあたり2 mL)を加えて、プレートから残留オルガノイドおよびECM材料を洗浄して回収します。P1000ピペットを使用してオルガノイドを再懸濁し、400 x g で5分間遠心分離します。
      注:すべての遠心分離ステップは、このプロトコルで特に指定されていない限り、室温で実行されます。
    7. 遠心分離後、オルガノイドを含む曇ったECMペレットが見えるはずです。ECMペレットを避けて、ピペット で 上清を慎重に吸引します。
    8. 冷やしたPBSで2回目のPBS洗浄を行い、P1000ピペットを使用して再懸濁し、400 x g で5分間遠心分離します。ピペット で 上清を吸引し、~100 μL の残留溶液を残します。
    9. 2 mLのトリプシン様プロテアーゼを15 mLのコニカルチューブ内のオルガノイドに加えます。P1000ピペットを使用して再懸濁します。37°Cで10〜12分間インキュベートし、チューブを反転またはフリックして、インキュベーションの途中で混合物を再懸濁します。
      注:オルガノイドを凝集体として通過させるために、10〜12分間のトリプシン様プロテアーゼ解離を行います。
    10. 12分後、ベースメディアに2 mLの2% FBSを添加して、トリプシン様プロテアーゼ反応を停止します(メディアを停止、 補足ファイル1を参照)。P1000ピペットで溶液を再懸濁し、400 x g で5分間遠心分離します。
    11. 上清を吸引し、10 μMのROCKiを添加したストップメディアにオルガノイドを再懸濁します。細胞計数用の10 μLサンプルを採取し、血球計算盤とトリパンブルーを使用します。カウント中はオルガノイドを氷の上に置いてください。
    12. ウェルあたり100,000個の細胞を得るために必要な量を計算します。アリコート細胞を1.5 mLの微量遠心チューブに凝集させ、400 x gで5分間遠心分離します。余分な上清を取り除き、10 μLの残存培地を残します。
    13. 細胞ペレットを200 μLの冷たいECMポリマーに再懸濁します(気泡を避け、早期重合を防ぐために迅速に作業してください)。200 μLのECMと細胞混合物を12ウェルプレートの各ウェルの底に加えます。ECMをバイオセーフティキャビネット内で室温で5分間部分的に重合させます。
    14. プレートを37°Cのインキュベーターに30〜60分間移し、ECM重合を完了します。次に、1.5 mLの気道オルガノイド導入培地(補足ファイル1)を追加します。
    15. 30日目までの14日間、隔日で媒体を交換してください。培地が24時間以内に黄色になった場合は、容量を2mLに増やします。

2. iPS細胞由来内皮細胞の作製(1日目〜14日目)

注:次の手順では、Patsch et al.18から採用されたiPS細胞(図1C)からの内皮細胞の生成について詳しく説明します。この方法には、プレートの調製、iPS細胞の分化、内皮細胞の誘導、選別、および増殖が含まれます。表1に、この研究で使用した抗体を示します。

  1. 内皮分化のためのiPS細胞のプレーティング(0日目)
    1. hiPSCが70%〜80%の密度に達したときに、内皮細胞の分化を開始します。解離の1時間前に、10 μMのROCKi Y-27632を各ウェルに加えます。
    2. 培地を吸引し、ウェルを1 mLのPBSで洗浄し、12ウェルプレートのウェルあたり1 mLの細胞剥離溶液を添加してiPS細胞を解離します。37°Cで20分間インキュベートします。
    3. 細胞剥離液を中和するには、2 mLのストップ培地をウェルに加えます。ピペットで単一細胞懸濁液を取得します。細胞を15 mLのコニカルチューブに移し、300 x gで5分間遠心分離します。
    4. 上清を吸引し、10 μMのROCKiを添加したiPS細胞培養培地にiPS細胞を再懸濁し、細胞数を計数します。ECMコーティングされた12ウェルプレートのウェルあたり100,000 hiPSCを、10 μMのROCKiを含む1 mLのiPS細胞培養培地にプレートします。37°Cで一晩インキュベートします。
      注:iPS細胞と内皮分化のための播種密度は、細胞株ごとに最適化が必要な場合があります。6日目にCD31のフローサイトメトリーを使用して分化効率を評価します。
  2. 外側中胚葉誘導(1-3日目)
    1. めっきしたiPS細胞からiPS細胞培養培地を吸引し、ウェルあたり6 μMのCHIRと25 ng/mLのBMP4を添加したN2B27ベース培地3 mLを添加します(補足ファイル1)。培地を細胞に加える前に温めてください。3日間はメディアを交換しないでください。
  3. 内皮細胞誘導(4-5日目)
    1. 4日目に、N2B27培地を吸引し、ウェルあたり200 ng/mLのVEGF165と2 μMのフォルスコリンを添加した2 mLの内皮分化培地(EDM)を添加します。5日目にメディアを交換します。
  4. 内皮細胞の選別と再プレーティング(6日目)
    1. 5日目または6日目に、1 mgのフィブロネクチンを滅菌水に再溶解して100 μg/mLのフィブロネクチン溶液を調製することにより、蛍光活性化細胞選別(FACS)濃縮用のフィブロネクチンコーティングT75フラスコを調製します。T75フラスコに6 mLのフィブロネクチン溶液をコーティングし、室温で1時間インキュベートします。フィブロネクチン溶液を吸引し、滅菌水で洗浄します。T75フラスコを室温で乾燥させます。予備のフラスコは4°Cで保存できます。
    2. 内皮維持培地(EMM)18を調製します。
    3. 6日目に、CD31抗体18を用いてFACSを介してiPS細胞由来内皮細胞を濃縮します。
    4. 37°Cで解離する1時間前に、10 μMのROCKi Y-27632を各ウェルに加えます。 メディウムを吸引し、PBSで洗います。12ウェルプレートのウェルあたり1 mLの温めた細胞剥離溶液を1 mL加え、37°Cで8〜10分間インキュベートします。
    5. シングルセルの剥離を確実にするために、静かにピペットで固定します。細胞を15 mLのコニカルチューブに移し、等量のストップ培地を加えます。300 x gで5分間遠心分離します。
    6. 上清を吸引し、10 μM の ROCKi を添加した 1 mL Stop 培地に内皮細胞を再懸濁します。 まず1mLのストップメディアを加えてフィルターを濡らし、次に細胞をフィルターにピペットで通し、70μmフィルターに細胞を通します。細胞計数用の10 μLサンプルを採取し、血球計算盤とトリパンブルーを使用します。カウント中は細胞を氷の上に置いてください。
    7. セルカウントを実行します。未染色のネガティブコントロールとして200,000個の細胞のアリコートを調製します。残りの細胞を1.5 mLのEppendorfチューブに移し、100 μLのFACSバッファーに100万個の細胞ごとに10 μLのCD31-APCを加えます。ローテーター上で4°Cで30分間インキュベートします。
    8. インキュベーションが完了したら、Eppendorfチューブを細胞入りで300 x gで5分間遠心分離し、PBSを1mL加えて細胞を洗浄します。洗浄と遠心分離のステップを2回繰り返します。洗濯の合間に上清を手動で取り除きます。
    9. ソーティングの5分前に、細胞ペレットを1 mLのFACSバッファーと5 ug/mL DAPI溶液に再懸濁して生存率を染色します。機関のガイドラインに従って並べ替えます。
    10. FACSで選別した細胞を、2 mLのEMMを入れた15 mLのコニカルチューブに集めます。15mLのコニカルチューブを細胞入りで300 x gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、10 μM の ROCKi Y-27632 とペニシリン ストレプトマイシン (1%) を添加した 10 mL の EMM に内皮細胞を再懸濁します。
    11. 再懸濁したFACSに富むiPS細胞由来内皮細胞をフィブロネクチンコーティングフラスコに移します。細胞を均等に分布させ、37°Cのインキュベーターに一晩置きます。
      注:T75フラスコあたり最小500,000個、最大2,000,000個の細胞を使用してください。
  5. 選別された内皮細胞の増殖と凍結保存(7日目+)
    1. EMMメディアは、FACS濃縮後2〜3日ごとに交換してください。T75フラスコがコンフルエントになると(FACSの約7日後、播種密度によって異なります)、iPS細胞由来の内皮細胞を共培養に使用したり、将来のアプリケーションのために凍結保存したりできます。
    2. 細胞解離前に2倍内皮凍結液を調製します(80% Endo-CM2、20% DMSO、20 μM のROCKi)。
    3. エタノールプルーフペンでクライオバイアルチューブにそれぞれの情報をラベル付けします。行ID、通過番号、培地、「6ウェルに解凍」、凍結日。
    4. 選別されたiPS細胞由来内皮細胞がコンフルエントになったら、解離を開始します。
    5. T75フラスコを5mlのPBS-/-で洗います。
    6. iPS細胞由来内皮細胞をT75あたり5mLのトリプシン様プロテアーゼで解離します。細胞を37°Cで10分間インキュベートし、T75を定期的にチェックして細胞が浮き上がったことを確認します。
    7. 5 mLのストップメディアを加えて反応を中和します。溶液中の細胞10 mLを15 mLチューブに移します。300 x g で5分間遠心分離します。
    8. 上清を吸引し、内皮細胞をE-CBM培地に再懸濁し、血球計算計 で 10μLのサンプルを取り出してカウントします。
    9. 細胞数後、EGM2培地0.5mLあたり100万個の細胞を分注します。
      注: 次の手順は時間的制約があります。すぐに使用できるクライオバイアルと凍結容器を準備します。
    10. 等量の2倍凍結溶液を内皮細胞に分注します。最終濃度は、90%Endo-CM2、10%DMO、および10μMのROCKi(1mL/100万細胞)です。
    11. 蓋をしたバイアルをすぐに冷凍チャンバーに移し、-80°Cで一晩置いた後、翌日液体窒素(-180°C)に入れて長期保存します。

3. iPS細胞由来マクロファージの作製(1日目〜26日目)

注:この手順では、van Wilgenburg et al.19およびPouyanfard et al.20から適応したiPS細胞(図1D)からマクロファージを生成する手順を概説しています。iPS細胞のシングルセル適応、胚様体分化、マクロファージ前駆細胞形成、マクロファージ成熟について解説しています。

  1. iPS細胞のシングルセル適応
    1. iPS細胞が分化の兆候が見られず、70%~90%のコンフルエントに達したら、トリプシン様プロテアーゼによるシングルセル継代を開始します。
    2. 使用済みメディアを吸引し、PBSですすいでください。PBSを除去し、トリプシン様プロテアーゼ(6ウェルプレート1 mL/ウェル、12ウェルプレート500 μL/ウェル)を添加します。iPSCコロニーがプレートから解離するまで、37°Cで2〜5分間インキュベートします。
    3. 等量のストップ培地(6ウェルプレート1 mL/ウェル、12ウェルプレート500 μL/ウェル)でトリプシン様プロテアーゼを中和します。細胞を200 x g で5分間遠心分離します。
    4. 上清を吸引し、10 μMのROCKiでiPS細胞培養培地に細胞を穏やかに再懸濁します。新しいECMコーティングプレートへの通路。凍結保存またはシングルセル適応iPS細胞を使用する前に、2〜3継代を繰り返します。
      注:継代比を1:2から1:10に調整します 細胞の健康状態と適応。さらに、少なくとも3回のシングルセル継代を経て、低継代のiPS細胞は、最適なマクロファージ分化をもたらします。
  2. 胚様体形成(0-6日目)
    1. シングルセル適応iPS細胞が~75%のコンフルエント度に達したら、ステップ3.1〜3.4に従ってトリプシン様プロテアーゼでiPS細胞を継代します。
    2. 細胞をStop Mediaに再懸濁し、70 μmの細胞ストレーナーを新しい50 mLのコニカルチューブに通して凝集体を除去します。細胞を再懸濁し、血球計算盤 で 細胞数のために10μLのサンプルを採取します。
    3. 胚様体(EB)作製では、96ウェル超低接着(ULA)プレートのウェルあたり8,000〜50,000個の細胞を播種します。96ウェルULAプレートの60ウェルの播種に必要な細胞の総数を計算します。
      注:iPS細胞の播種密度は、細胞株ごとに最適化が必要な場合があります。
    4. iPSCを15 mLの円錐形に200 x g で5分間遠心分離します。上清を吸引します。
    5. 480,000 iPSC(8,000細胞/ウェル、60ウェル)の場合、6 mL(100 ul/ウェル、60ウェル)EB誘導培地に再懸濁します。
    6. 丸底の96ウェルULAプレートの36個のアウターウェルに150μLのPBSを添加します。
    7. EBメディア中のiPSCを再懸濁し、メディアトラフに移します。マルチチャンネルピペットを使用して、100 μL/ウェルの細胞懸濁液を96ウェルULAプレートの中央60ウェルに加えます。iPS細胞をEB培地に断続的に再懸濁し、細胞が均一に分布するようにします。
    8. 96ウェルプレートを300 x g で4°C、5分間遠心分離します(利用可能な場合)。プレートを37°Cのインキュベーターに移します。
    9. 48〜72時間後、メディアの50μLを交換します(半分のメディア交換)。6日後に嚢胞形成を確認します。
      注:一部のiPSC系統は、他の系統よりも早く、またはより容易にEBを形成します。EB形成をモニターし、EBが適切な時点で転写されていることを確認します(嚢胞を発症しているはずです)。
  3. マクロファージ前駆細胞形成のためのゼラチンコーティングとEB転写(6-19日目)
    1. 0.1%ゼラチンコーティングされた6ウェルプレートを2枚調製します。ウェルあたり0.1%ゼラチン1mLを加え、室温で20分間インキュベートします。ゼラチン溶液を吸引し、プレートをフード内で30〜60分間乾燥させます。
    2. 2 mLの血清ピペットを使用して、96ウェルプレートからゼラチンコーティングされた6ウェルプレートにEBを移します。6ウェルゼラチンコーティングプレートのウェルあたり約8〜10EBを分配します。
    3. 使用した残留EBメディアを転写から慎重に取り除きます。1ウェルあたり2 mLのマクロファージ培地1(Mac-CM1)を添加します。EBを37°Cで5%CO2 と共に乱さずに5〜7日間インキュベートします。
      注:理想的には、胚様体の1つの96ウェルプレートを2つの6ウェルプレートに分割できます。EBの発達が不十分な場合は、6ウェルプレートあたりに転送されるEBの数を調整して、iPS細胞から胚様体への分化ステップを最適化できます。
  4. マクロファージ前駆細胞の作製
    1. メディアの2/3を週に2回交換し、メディアの色が変わった場合は容量を3mLに増やします。
    2. 8日目から19日目までの培養物をチェックして、マクロファージ前駆細胞の収穫の準備ができているかどうかを判断します。EBが剥がれた場合は、Mac-CM1でコーティングしたばかりのプレートにEBを移し、7日間邪魔されずにインキュベートします。
      注:マクロファージ前駆細胞形成複合体の維持は、マクロファージ前駆細胞の発生および連続的な生成に不可欠です。最適化されたマクロファージ前駆細胞形成複合体は、2〜6 +か月間骨髄前駆細胞を継続的に生成します。
  5. 骨髄系前駆細胞の採取 (19-26日目+)
    1. マクロファージ前駆細胞が懸濁液中に存在する場合は、細胞で培地を回収し、50 mLのコニカルチューブに移します。200 x g で5分間遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。
    2. マクロファージ前駆細胞をMac-CM2に再懸濁し、未処理の無菌培養皿/フラスコに移します。5% CO2 と共に 37 °C で 3-4 日間インキュベートします。
      注:回収した細胞の数に応じて、10 cmシャーレ(6ウェルプレートの3〜4ウェル)、T25フラスコ(6ウェルプレートの1〜2ウェル)、またはT75フラスコ(フル6ウェルプレート)に適切な量の培地を移します。T25フラスコには5〜6 mLの培地を、ペトリ皿には10〜12 mLの培地を、T75フラスコには12〜15 mLの培地を使用します。その後の収穫では、骨髄系前駆細胞とマクロファージ細胞が同じ系統/骨髄形成複合体からのものである場合、以前の収穫からプールすることができます。フラスコがフラスコ内の細胞の数を維持し、供給するのに十分であることを確認してください。マクロファージは増殖しません。それらはマクロファージ前駆細胞から生成されます。マクロファージは、発現マーカーを失うことなく、2〜6週間プールして維持することができます。
  6. マクロファージの収穫
    注:Mac-CM2培地でのマクロファージ分化の14日後、マクロファージ培養物は共培養またはフローサイトメトリー分析の準備が整います。
    1. 使用済み培地を回収し、50mLのコニカルチューブに移します。フラスコ/プレートをPBSですすぎ、残留培地と細胞を取り除きます。
    2. フラスコにベース培地(T25の場合は3 mL、T75の場合は5 mL)を追加し、滅菌セルスクレーパーを使用してフラスコ/プレートの底から細胞を剥離します。細胞を円錐形のチューブに移し、必要に応じて掻き取りを繰り返します。
    3. 200 x g で室温で5分間遠心分離します。上清を慎重に除去し、さらに使用するために細胞を適切な培地または緩衝液に再懸濁します。

4. 気道細胞、内皮細胞、マクロファージの共培養

注:この手順では、Costa et al.12から採用された細胞培養インサートを使用して、気道細胞、内皮細胞、およびマクロファージ(図1A)を共培養する手順について説明します。

  1. 共培養用細胞培養インサートのECMコーティング(共培養0日目)
    1. 3.0 μmポアポリエステル(PET)細胞培養インサートに4 mg/mL ECM溶液を塗布します。プレート内の細胞培養インサートインサートの頂端側を4 mg/mLのECM溶液で短時間コーティングします。残留ECM溶液をピペットでオフします。プレートをインキュベーターに37°Cで1時間置きます。
    2. 大きなシャーレ(100 mm x 20 mmまたは150 mm x 20 mm)を入手します。清潔なピンセットを使用して、細胞培養インサートを12ウェルプレートから大きなペトリ皿に無菌で移します。インサートを反転させて、基底側が直立するようにします。
    3. 基底外側を4 mg/mL ECM溶液でコーティングします。残留ECM溶液をピペットでオフします。ECMコーティングされた細胞培養インサートを施したペトリ皿を37°Cのインキュベーターに入れ、一晩乾燥させます。
  2. iPS細胞由来内皮細胞の解離とプレーティング(共培養1日目)
    1. T75フラスコをPBSで洗い、溶液を吸引します。5 mLのトリプシン様プロテアーゼをT75フラスコに加え、37°Cで8分間インキュベートします。内皮細胞がフラスコから浮き上がったことを視覚的に評価します。
      注:iPS細胞由来の内皮細胞がフラスコから浮き上がっていない場合は、タイプシン様プロテアーゼの解離の時間を増やしてください。
    2. フラスコを軽く叩いて内皮細胞の剥離を確認し、細胞を15mLの円錐形に移します。5 mLのストップメディアを加えて、解離を停止します。細胞を300 x g で5分間遠心分離します。
    3. 上清を吸引し、細胞ペレットを10 μMのROCKiを含む1 mLの内皮培養培地に再懸濁します。細胞カウント用に10 μLの再懸濁溶液を入手し、カウント中に細胞を氷上に置きます。
    4. 100 μLの内皮培養培地に12 mmの細胞培養インサートあたり150,000個のiPS細胞を使用します。それぞれのメディア容量を調整して、インサートあたりのセル数に到達します。
    5. ECMコーティングされた3.0 μm細胞培養インサートを装着したペトリ皿をインキュベーターから取り出します(ステップ4.1-4.3を参照)。
    6. iPS細胞内皮細胞を再懸濁し、150,000個の細胞を入れた100 μLを倒立細胞培養インサート(基底外側を上に向けて)にピペットで移します。調製した細胞培養インサートごとにピペッティングを繰り返します
    7. 細胞を慎重にインキュベーターに移し、3時間放置します。
    8. 12ウェルプレートに、各ウェルに1 mLの内皮培養培地を加えます(調製した細胞培養インサートのそれぞれの数について)。
    9. インキュベーターから内皮細胞の入ったペトリ皿を取り出します。清潔なピンセットを使用して、細胞培養インサートを内皮培養培地を入れたプレートに慎重に移します(インサートを裏返して、底が培地に下を向くようにします)。
    10. 内皮細胞が付着していたことを顕微鏡で目視で確認します。プレートを37°Cのインキュベーターに一晩置きます。
  3. iPS細胞由来気道オルガノイドの解離とプレーティング(共培養2日目)
    注:ECMポリマーからの気道オルガノイドの単離については、ステップ1.1.1-1.1.15を参照してください。トリプシン様プロテアーゼ(ステップ1.1.10)解離の持続時間を15〜20分に変更して、単一細胞懸濁液を取得します。
    1. 15〜20分後、3 mLのストップメディアを追加してトリプシン様プロテアーゼ反応を停止します。.P1000ピペットで溶液を再懸濁し、400 x g で5分間遠心分離します。
    2. 上清を吸引し、10 μMのROCKiを含む1 mLの気道拡張培地に気道オルガノイドを再懸濁します。血球計算盤の細胞数のために10 μLのサンプルを採取し、カウント中に細胞を氷上に置きます。
    3. 12 mm細胞培養インサートあたり500 μLの気道拡大培地に300,000個のiPSC気道細胞を播種します。それぞれの培地の量を調整して、準備したインサートごとに必要なセル数に到達します。
    4. 内皮細胞(基底外側に播種)が入った細胞培養インサートのあるプレートを37°Cインキュベーターから取り出します。
    5. iPS細胞-airway細胞を再懸濁し、300,000個の細胞を含む500μLを各細胞培養インサートの頂端チャンバーにピペットで移します。プレートを37°Cのインキュベーターに48時間置き、頂端細胞を液液条件にします。
  4. 空輸共培養(共培養4日目)
    1. 細胞培養インサートの頂端側から培地を取り出します。基底外側培地を1:1気道分化培地および内皮培養培地に変更します。プレートをインキュベーターに戻します。
  5. iPS細胞由来マクロファージの解離とプレーティング(共培養5日目)
    1. 細胞スクレーパーを使用して、iPSC由来マクロファージをフラスコから解離します(ステップ3.22-3.24を参照)。300 x g で5分間遠心分離し、上清を吸引します。
    2. iPSCマクロファージをMac-CM2 1 mLに再懸濁します。細胞計数用に10 μLのサンプルを採取し、カウント中に細胞を氷上に置きます。マクロファージの数は、播種された気道細胞の数を反映します(マクロファージと気道細胞の比率は1:1)。
    3. 細胞数後、調製した細胞培養インサートのウェルあたり35 μL培地に300,000個のマクロファージを1.5 mLの微量遠心チューブに分注します。200 x g で5分間遠心分離します。
    4. 遠心分離後、上清をピペットで取り出します。各Mac-CM2のマクロファージを計算から再懸濁します。
    5. 内皮細胞と気道細胞の共培養物を入れたインサートをインキュベーターから取り出します。35 μLのMac-CM2に300,000個のマクロファージを播種し、細胞培養インサートの頂端側に播種します。プレートを37°Cのインキュベーターに48時間置きます。
      注:iPS細胞免疫細胞の細胞培養インサートへの付着を確認するために、細胞を蛍光プローブでタグ付けすることができます。顕微鏡 法による 接着性を顕微鏡で確認し、マクロファージプレーティングの48時間後に蛍光シグナルを検出します。
  6. トリプル共培養(共培養7日目)
    1. 共培養物が、感染研究、経上皮電気抵抗(TEER)測定、バリア完全性アッセイなどのダウンストリームアプリケーションに対応していることを確認します。

結果

iPS細胞由来気道オルガノイド、内皮細胞、免疫細胞、共培養の分化が成功したと評価できる段階は複数あります。分化は異なるiPS細胞系統で行うことができ、このプロトコルは少なくとも5つの異なる系統で試験されています。このプロトコルは、特に播種密度を変更および最適化することにより、すべての新しいiPS細胞株に適合させる必要があります。

ディスカッション

ウイルス感染やその他の毒素を研究するための大気道における血液-空気関門のモデルの開発と実施には、関与するさまざまな細胞タイプの分化と機能を成功させるために、細部に細心の注意を払う必要があります。このディスカッションでは、差別化を成功させるための主要な要因、潜在的な課題、代替アプリケーション、およびヒトの疾患の研究への影響につい?...

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

本研究はCIRM(DISC2COVID19-12022)の支援を受けて行われました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
12 well platesCorning3512
12-well inserts, 0.4 µm, translucent VWR10769-208
2-mercaptoethanol Sigma-AldrichM3148
AccutaseInnovative Cell TechAT104
Activin AR&D Systems338-AC
All-trans retinoic acid (RA) Sigma-AldrichR2625
ascorbic acidSigmaA4544
B27 without retinoic acid ThermoFisher12587010
BMP4 R&D Systems314-BP/CF
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution Gibco15260-037
Br-cAMPSigma-AldrichB5386
CD 14 (FITC)BioLegend982502
CD 31 PECAM-1(APC)R&D SystemFAB3567A
CD 45 (PE)BD Biosciences560975
CD 68 (PE)BioLegend33808
CHIR99021 Abcamab120890
CPMFujifilm014-27501
Dexamethasone Sigma-AldrichD4902
Dispase StemCellTech7913
DMEM/F12 Gibco10565042
DorsomorphinR&D Systems3093
E-CAD/CD 324 (APC)BioLegend324107
EGFR&D Systems236-EG
EGM2 MediumLonzaCC-3162
EPCAM/CD 326 (APC)BioLegend324212
FBS Gibco10082139
FGF10R&D Systems345-FG/CF
FGF7R&D Systems251-KG/CF
FibronectinFisher356008
ForskolinAbcamab120058
Glutamax Life Technologies35050061
Ham’s F12 Invitrogen11765-054
HEPESGibco15630-080
IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)Sigma-AldrichI5879
IL-3Peprotech200-03
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax Invitrogen31980030
Knockout Serum Replacement (KSR)Life Technologies10828028
MatrigelCorning354230
M-CSFPeprotech 300-25
Monothioglycerol SigmaM6145
mTeSR plus Kit (10/case)Stem Cell Tech5825
N2 ThermoFisher17502048
NEAALife Technologies11140050
PBSGibco10010023
Pen/strepLonza17-602F
ReleSRStem Cell Tech5872
RPMI1640 + Glutamax Life Technologies12633012
SB431542 R&D Systems1614
SCFPeproTech300-07
SMAInvitrogen50-9760-80
STEMdiff APEL 2 MediumSTEMCELL Technologies5275
TrypLE ExpressGibco12605-028
VEGF165Preprotech100-20
VimentinCell Signaling5741S
Y-27632 (Rock Inhibitor) R&D Systems1254/1
ZO-1Invitrogen339100

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