JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной статье описывается создание сложной многоклеточной модели барьера дыхательных путей, состоящей из эпителия легких, полученного из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), мезенхимы, эндотелиальных клеток и макрофагов в культуре воздушно-жидкостного интерфейса.

Аннотация

Легочная ткань человека состоит из взаимосвязанной сети эпителия, мезенхимы, эндотелия и иммунных клеток от верхних дыхательных путей носоглотки до мельчайшего альвеолярного мешка. Взаимодействие между этими клетками имеет решающее значение для развития легких и заболеваний, выступая в качестве барьера против вредных химических веществ и патогенов. В современных моделях совместного культивирования in vitro используются иммортализированные клеточные линии с различным биологическим фоном, которые могут неточно отражать клеточную среду или взаимодействия легких. Мы дифференцировали ИПСК человека на 3D органоиды легких (содержащие как эпителий, так и мезенхиму), эндотелиальные клетки и макрофаги. Их совместно культивировали в формате воздушно-жидкостного интерфейса (ALI) для формирования эпителиального/мезенхимального апикального барьера, наполненного макрофагами, и базолатерального эндотелиального барьера (iAirway). iAirways, полученные из iPSC, показали снижение целостности барьера в ответ на заражение респираторными вирусами и сигаретными токсинами. Эта многолинейная система совместного культивирования легких обеспечивает платформу для изучения клеточных взаимодействий, сигнальных путей и молекулярных механизмов, лежащих в основе развития легких, гомеостаза и прогрессирования заболевания. iAirways точно имитирует физиологию человека и клеточные взаимодействия, может быть сгенерирован из ИПСК пациента и может быть настроен для включения различных типов клеток дыхательных путей. В целом, модели iAirway, полученные на основе iPSC, предлагают универсальный и мощный инструмент для изучения целостности барьера, чтобы лучше понять генетические факторы заболевания, реакцию патогенов, иммунную регуляцию и открытие или перепрофилирование лекарств in vitro, с потенциалом для улучшения нашего понимания и лечения заболеваний дыхательных путей.

Введение

Кроветворно-воздушный барьер в крупных дыхательных путях включает трахею, бронхи и бронхиолы. Он играет решающую роль в поддержании здоровья дыхательных путей и состоит из эпителия дыхательных путей, базальной мембраны, кровеносных сосудов и эндотелиальных клеток, а также иммунных клеток. Первичные эпителиальные клетки в дыхательных путях включают базальные клетки, булановые клетки, реснитчатые клетки и бокаловидные клетки. Базальные клетки, выступающие в качестве стволовых клеток эпителия дыхательных путей, являются мультипотентными предшественниками с высокими пролиферативными и самообновляющимися способностями, дающими начало зрелым эпителиальным клеткам дыхательных путей1. Клубные клетки представляют собой нереснитчатые секреторные клетки, которые способствуют поддержанию слизистой оболочки дыхательных путей путем секреции защитных белков и поверхностно-активных веществ2. Бокаловидные клетки, расположенные в просвете и в подслизистых железах, выделяют муцины для улавливания мусора и защиты дыхательных путей3. Реснитчатые клетки являются неотъемлемой частью механизма мукоцилиарного эскалатора, предотвращая накопление вредных микроорганизмов4. Базальная мембрана состоит из внеклеточного матрикса, который обеспечивает структурную поддержку5. Трахея и остальные дыхательные пути окружены обширной сетью кровеносных сосудов, выстланных эндотелиальными клетками, играющими жизненно важную роль в поддержании функции трахеи, поставляя питательные вещества и кислород, удаляя отходы, регулируя воспаление и способствуя восстановлению тканей и ангиогенезу. Наконец, макрофаги дыхательных путей являются тканеспецифическими иммунными клетками, необходимыми для защиты дыхательной системы от инфекций, очистки от вдыхаемых частиц и поддержания сбалансированного иммунного ответа.

Скоординированные действия эпителиальных, мезенхимальных, эндотелиальных клеток и макрофагов имеют решающее значение для эффективного иммунного ответа на патогены в дыхательных путях8. Эпителиальные клетки образуют первую линию защиты от вирусных инфекций, действуя как физический барьер с плотными соединениями, ограничивающими прохождение вредных веществ. Скоординированное действие реснитчатых клеток и бокаловидных клеток помогает улавливать и удалять вдыхаемые частицы, патогены и мусор4. Кроме того, эпителиальные клетки дыхательных путей продуцируют цитокины и хемокины для привлечения иммунных клеток9. Эндотелиальные клетки поддерживают целостность сосудов, предотвращая распространение вирусных частиц по кровотоку, активируют молекулы адгезии (VCAM-1) для облегчения адгезии иммунных клеток и продуцируют провоспалительные цитокины для привлечения иммунных клеток из кровотока к месту инфекции10. Макрофаги дыхательных путей поглощают и переваривают вирусные частицы, инфицированные клетки и мусор, представляют вирусные антигены Т-клеткам и продуцируют цитокины для активации и рекрутирования других иммунных клеток, а также интерфероны I типа для ингибированиярепликации вируса. Скоординированные действия эпителиальных, мезенхимальных, эндотелиальных и макрофагальных клеток создают надежную и динамичную защитную систему, которая защищает дыхательные пути от вирусных инфекций и поддерживает здоровье дыхательных путей.

Понимание динамических взаимодействий между различными типами клеток в легких человека имеет решающее значение для понимания реакции легких на вирусные инфекции, воспалительные заболевания и доставку лекарств. Кокультуры in vitro позволяют изучать межклеточную передачу сигналов между эпителием, эндотелиальными клетками и клетками врожденного иммунитета12. Мы разработали первую аутентичную модель легких многоклеточного типа, полученную из специфичных для пациента ИПСК13. Он включает в себя как эпителиальные, так и мезенхимальные клеточные популяции, сформированные в 3D-ориентации. Впоследствии клетки-предшественники легких могут быть дифференцированы в «органоид дыхательных путей»14, культивированы на стерильных клеточных культуральных вкладышах и подвергнуты воздействию воздушно-жидкостного интерфейса (ОПЛ), воспроизводя условия дыхательных путей человека 15,16,17. Эндотелиальные клетки, полученные из iPSC, культивируются на базолатеральной стороне мембраны, имитируя их ориентацию в дыхательных путях человека, расположенных ниже эпителиального/мезенхимального слоя в базальной мембране. Наконец, макрофаги, полученные из iPSC, добавляются к апикальной стороне мембраны, взаимодействуя с эпителиальными клетками и ожидая сигналов активации (рис. 1A). Эта модель точно воспроизводит биологию и функцию дыхательных путей. Мы утверждаем, что полученные из hiPSC, специфичные для пациента, аутентичные многоклеточные культуры iAirway лучше всего подходят для выяснения внутренней, острой реакции барьера дыхательных путей и патогенов, включая вирусные инфекции. Например, эта модель может быть использована для (1) изучения проникновения и репликации вируса, (2) исследования первоначального иммунного ответа эпителиальных и тканеспецифических иммунных клеток, (3) изучения целостности и функции барьера, (4) проверки эффективности терапевтических агентов и (5) изучения клеточных и молекулярных механизмов патогенеза в модели, специфичной для пациента.

В данной статье описан подробный протокол подготовки многоклеточных кокультур легких для изучения клеточных реакций на вирусные инфекции.

протокол

Этот протокол исследования был одобрен Институциональным наблюдательным советом Программы защиты исследований на людях Калифорнийского университета в Сан-Франциско (181180). В этом протоколе используются малые молекулы и факторы роста для дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в клетки дыхательных путей, эндотелиальные клетки и макрофаги. Затем эти клетки совместно культивируются на вставках для клеточных культур и поляризуются на границе раздела воздух-жидкость. Подробная информация об используемых реагентах, расходных материалах и оборудовании приведена в Таблице материалов. Композиции носителей и буферов представлены в дополнительном файле 1.

1. Генерация органоидов дыхательных путей, полученных из iPSC (день 1 - 30)

ПРИМЕЧАНИЕ: В данном протоколе описаны шаги, необходимые для получения органоидов дыхательных путей, полученных из ИПСК (Рисунок 1B), в соответствии с методологией, описанной в Leibel et al.13. Процесс включает в себя индукцию окончательной энтодермы (дни 1-3), генерацию энтодермы передней части передней кишки (дни 4-6) и дифференцировку в легочных предшественников (дни 7-16). С подробной методологией можно ознакомиться в предыдущей публикации13. Следующие шаги подробно описывают получение органоидов дыхательных путей от предшественников легких.

  1. Экстракция и диссоциация сфероидов-предшественников легких из полимера ECM (17-й день)
    1. Разморозьте полимер внеклеточного матрикса (ВКМ) (8-9 мг/мл) на льду.
    2. Аспиратируйте отработанные среды, используя вакуумный аспиратор, из органоидов легких, встроенных в ВКМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для последующих этапов аспирации используйте вакуумный аспиратор, если не указано иное.
    3. Добавьте 1 мл диспазы 2 ЕД/мл с добавлением 10 мкМ ингибитора ROCK1 (ROCKi) в клетки и используйте пипетку P1000 для ручной ресуспензии предшественников легких в ЭКМ. Инкубировать в течение 30 минут при 37 °C, повторно суспендируя смесь каждые 15 минут для повышения эффективности диссоциации за счет механической обработки.
    4. За 15 минут до использования поместите 45 мл PBS комнатной температуры в морозильную камеру при температуре -20 °C для охлаждения. Убедитесь, что PBS ниже 4 °C для оптимальной деполимеризации ECM на последующих этапах.
    5. После 30 минут инкубации перенесите органоид и раствор в коническую пробирку объемом 15 мл.
    6. Добавьте охлажденный PBS (2 мл на 1 мл протеазы) для промывки и соберите остатки органоида и материала ECM с пластины. Ресуспендирование органоидов с помощью пипетки P1000 и центрифуги при давлении 400 x g в течение 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы центрифугирования выполняются при комнатной температуре, если иное не указано в данном протоколе.
    7. После центрифугирования должна быть видна мутная гранула ECM с органоидами. Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость через пипетку, избегая попадания гранул ВКМ.
    8. Проведите вторую промывку PBS охлажденным PBS, повторно суспендируйте с помощью пипетки P1000 и центрифугируйте при 400 x g в течение 5 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость через пипетку, оставляя ~100 мкл остаточного раствора.
    9. Добавьте 2 мл трипсиноподобной протеазы к органоидам в конической пробирке объемом 15 мл. Восстановите суспензию с помощью пипетки P1000. Инкубируйте в течение 10-12 минут при температуре 37 °C, переворачивая или переворачивая трубку, чтобы повторно суспендировать смесь в середине инкубации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните 10-12 минут диссоциации трипсин-подобной протеазы, чтобы передать органоиды в виде агрегатов.
    10. Через 12 мин остановите реакцию трипсин-подобной протеазы, добавив 2 мл 2% FBS в базовую среду (Stop Media, см. Дополнительный файл 1). Суспендируйте раствор с помощью пипетки P1000 и центрифугируйте при давлении 400 x g на 5 минут.
    11. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте органоиды в Stop Media с добавлением 10 мкМ ROCKi. Возьмите образец объемом 10 мкл для подсчета клеток с помощью гемоцитометра и трипанового синего цвета. Держите органоиды на льду во время подсчета.
    12. Рассчитайте объем, необходимый для получения 100 000 ячеек на лунку. Аликвотные клетки агрегируются в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируются в течение 5 мин при давлении 400 x g. Удалите излишки надосадочной жидкости, оставив 10 мкл остаточной среды.
    13. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 200 μл холодного полимера ECM (избегайте образования пузырей и работайте быстро, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию). Добавьте по 200 мкл ЭБМ и смеси ячеек на дно каждой лунки в 12-луночный планшет. Дайте ECM частично полимеризоваться при комнатной температуре в шкафу биобезопасности в течение 5 минут.
    14. Перенесите планшет в инкубатор с температурой 37 °C на 30-60 минут для завершения полимеризации ECM. Затем добавьте 1,5 мл органоидной среды для индукции дыхательных путей (Дополнительный файл 1).
    15. Меняйте носитель через день в течение 14 дней до 30 дня. Если среда стала желтой в течение 24 ч, увеличьте объем до 2 мл.

2. Генерация эндотелиальных клеток, полученных из iPSC (день 1 - 14)

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура подробно описывает получение эндотелиальных клеток из ИПСК (рис. 1C), адаптированную из Patsch et al.18. Этот метод включает в себя подготовку пластин, дифференцировку иПСК, индукцию эндотелиальных клеток, сортировку и экспансию. В таблице 1 перечислены антитела, использованные в этом исследовании.

  1. Осаждение иПСК для дифференцировки эндотелия (день 0)
    1. Дифференцировка эндотелиальных клеток начинается, когда ИПСК достигают 70%-80% конфлюенции. Добавьте 10 мкМ ROCKi Y-27632 в каждую лунку за час до диссоциации.
    2. Отсадите среду, промойте лунки 1 мл PBS, затем диссоциируйте иПСК, добавив 1 мл раствора для отделения клеток на лунку 12-луночного планшета. Инкубировать в течение 20 минут при 37 °C.
    3. Нейтрализуйте раствор для отслоения клеток, добавив в лунки 2 мл Stop Medias. Пипеткой получить одноклеточную суспензию. Перенесите ячейки в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте в течение 5 минут при давлении 300 x g.
    4. Аспирируйте надосадочную жидкость, ресуспендируйте иПСК в питательных средах с добавлением 10 мкМ ROCKi и проведите подсчет клеток. Планшет 100 000 hiPSC на лунку 12-луночного планшета с покрытием ECM в 1 мл питательной среды iPSC с 10 μM ROCKi. Инкубировать в течение ночи при 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность посева для дифференцировки iPSC-эндотелия может потребовать оптимизации для каждой клеточной линии. Оцените эффективность дифференцировки с помощью проточной цитометрии для CD31 на 6-й день.
  2. Индукция латеральной мезодермы (день 1-3)
    1. Отсадите питательную среду iPSC из покрытых iPSCs и добавьте 3 мл базовой среды N2B27 с добавлением 6 μM CHIR и 25 нг/мл BMP4 на лунку (Дополнительный файл 1). Подогрейте среду перед добавлением ее в ячейки. Не меняйте носитель в течение 3 дней.
  3. Индукция эндотелиальных клеток (4-5 день)
    1. На 4-й день аспирируйте среду N2B27 и добавьте 2 мл эндотелиальной дифференцировочной среды (ЭДМ) с добавлением 200 нг/мл VEGF165 и 2 мкМ форсколина на лунку. Смените носитель на 5-й день.
  4. Сортировка и повторное покрытие эндотелиальных клеток (день 6)
    1. На 5 или 6-й день приготовьте покрытую фибронектином колбу T75 для обогащения флуоресцентно-активируемой сортировкой клеток (FACS) путем восстановления 1 мг фибронектина в стерильной воде с получением 100 мкг/мл раствора фибронектина. Смажьте колбу Т75 6 мл раствора фибронектина и выдерживайте при комнатной температуре в течение одного часа. Отсадите раствор фибронектина и промойте стерильной водой. Дайте колбе Т75 высохнуть при комнатной температуре. Изготовленные дополнительные колбы можно хранить при температуре 4 °C.
    2. Приготовьте среду для поддержания эндотелия (ЭММ)18.
    3. На 6-й день обогащайте эндотелиальные клетки, полученные из iPSC, с помощью FACS с использованием антитела CD3118.
    4. Добавьте 10 μМ ROCKi Y-27632 в каждую лунку за час до диссоциации при 37°C. Отсадите среду и промойте PBS. Добавьте 1 мл предварительно подогретого раствора для отделения клеток на лунку 12-луночного планшета и инкубируйте в течение 8-10 мин при 37°С.
    5. Аккуратно пипеткой, чтобы обеспечить отслоение одной клетки. Переложите ячейки в коническую пробирку объемом 15 мл и добавьте равное количество стоп-среды. Центрифуга в течение 5 мин при 300 x g.
    6. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте эндотелиальные клетки в 1 мл стоп-среды с добавлением 10 мкМ ROCKi.  Пропустите клетки через фильтр 70 мкм, сначала добавив 1 мл стопорного фильтрующего материала для увлажнения фильтра, затем пропустите клетки через фильтр. Возьмите образец объемом 10 мкл для подсчета клеток с помощью гемоцитометра и трипанового синего цвета. Держите клетки на льду во время подсчета.
    7. Выполните подсчет ячеек. Приготовьте аликвоту из 200 000 клеток в качестве неокрашенного отрицательного контроля. Перенесите оставшиеся клетки в пробирку Eppendorf объемом 1,5 мл и добавьте 10 мкл CD31-APC на каждый 1 миллион клеток в 100 мкл буфера FACS. Инкубировать в течение 30 минут на ротаторе при температуре 4 °C.
    8. После завершения инкубации центрифугируйте пробирку Eppendorf с клетками в течение 5 минут при 300 x g, промойте клетки, добавив 1 мл PBS. Повторите этап промывки и центрифугирования дважды. Вручную удаляйте надосадочную жидкость между стирками.
    9. За 5 минут до сортировки суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл буфера FACS и 5 мкг/мл раствора DAPI для окрашивания на жизнеспособность. Сортируйте в соответствии с институциональными рекомендациями.
    10. Соберите отсортированные с помощью FACS клетки в коническую пробирку объемом 15 мл с 2 мл EMM. Центрифугируйте коническую пробирку объемом 15 мл с ячейками в течение 5 минут при 300 x g. Аспирировать надосадочную жидкость и ресуспендировать эндотелиальные клетки в 10 мл ЭММ с добавлением 10 мкМ ROCKi Y-27632 и пенициллина стрептомицина (1%).
    11. Перенесите ресуспендированные эндотелиальные клетки, полученные из iPSC, обогащенные FACS, в колбу, покрытую фибронектином. Равномерно распределите ячейки и поместите в инкубатор при температуре 37 °C на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте минимум 500 000 ячеек и максимум 2 000 000 ячеек на колбу T75.
  5. Экспансия и криоконсервация отсортированных эндотелиальных клеток (день 7+)
    1. Меняйте среду EMM каждые 2–3 дня после обогащения FACS. После того, как колба с Т75 становится сливающейся (примерно через 7 дней после FACS, в зависимости от плотности посева), эндотелиальные клетки, полученные из iPSC, могут быть использованы для совместного культивирования или криоконсервированы для будущих применений.
    2. Перед диссоциацией клеток приготовьте 2-кратный раствор для замораживания эндотелия (80% Endo-CM2, 20% ДМСО, 20 мкМ ROCKi).
    3. Пометьте криовиальные пробирки в ручке, устойчивой к этанолу, соответствующей информацией. ID строки, номер прохода, питательная среда, «разморозить в 6 лунок», дата заморозки.
    4. Когда отсортированные эндотелиальные клетки, полученные из iPSC, сливаются, инициируют диссоциацию.
    5. Вымойте колбу T75 5 мл PBS -/-.
    6. Диссоциация эндотелиальных клеток, полученных из iPSC, с помощью 5 мл трипсин-подобной протеазы на T75. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение 10 минут, периодически проверяя T75, чтобы убедиться, что клетки поднялись.
    7. Нейтрализуйте реакцию, добавив 5 мл Stop Media. Перенесите 10 мл клеток в растворе в 15 мл пробирки. Центрифугируйте при 300 х г в течение 5 мин.
    8. Аспирируйте надосадочную жидкость, ресуспендируйте эндотелиальные клетки в среде E-CBM и возьмите образец 10 мкл для подсчета с помощью гемацитометра.
    9. После подсчета клеток необходимо использовать 1 миллион клеток на 0,5 мл среды EGM2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий шаг чувствителен ко времени. Подготовьте криовиалы и морозильные сосуды для немедленного использования.
    10. Аликвота равна объему 2-кратного замораживающего раствора к эндотелиальным клеткам. Конечная концентрация составляет 90% эндо-CM2, 10% DMO и 10 мкМ ROCKi (1 мл/1 млн клеток).
    11. Укупоренные флаконы сразу переложите в морозильную камеру и поместите на ночь при температуре -80 °C, а на следующий день — в жидкий азот (-180 °C) для длительного хранения.

3. Генерация макрофагов, полученных из iPSC (день 1 - 26)

ПРИМЕЧАНИЕ: В этой процедуре описаны шаги по получению макрофагов из ИПСК (рисунок 1D), адаптированных из van Wilgenburg et al.19 и Pouyanfard et al.20. Она охватывает адаптацию одиночных клеток ИПСК к другим клеткам, дифференцировку эмбриоидных телец, образование предшественников макрофагов и созревание макрофагов.

  1. Адаптация иПСК к одиночным клеткам
    1. Когда ИПСК достигают ~70%-90% конфлюенции без видимых признаков дифференцировки, начинается пассаж одиночных клеток с трипсин-подобной протеазой.
    2. Отсадите отработанную среду и промойте PBS. Удалите PBS и добавьте трипсиноподобную протеазу (1 мл/лунка 6-луночного планшета, 500 мкл/лунка 12-луночного планшета). Инкубировать при 37 °C в течение 2-5 мин до тех пор, пока колонии iPSC не отделятся от планшета.
    3. Нейтрализуйте трипсин-подобную протеазу с помощью равного объема стоп-среды (1 мл/лунка 6-луночного планшета, 500 мкл/лунка 12-луночного планшета). Центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 5 минут.
    4. Аспирируйте надосадочную жидкость и мягко ресуспендируйте клетки в питательных средах iPSC с 10 мкМ ROCKi. Проход на новые пластины с покрытием ECM. Повторите в течение 2-3 пассажей перед криоконсервацией или использованием адаптированных для одного клетки иПСК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте соотношение пассажа от 1:2 до 1:10 в зависимости от здоровья и адаптации клеток. Кроме того, иПСК, которые прошли не менее трех одноклеточных пассажей и находятся на низком пассаже, обеспечивают оптимальную дифференцировку макрофагов.
  2. Формирование эмбриоидного тела (день 0-6)
    1. Когда адаптированные к отдельным клеткам иПСК достигают ~75% конфлюенции, проводят ИПСК с трипсин-подобной протеазой в соответствии с этапами 3.1-3.4.
    2. Ресуспендируйте клетки в Stop Media и пропустите через клеточное сетчатое фильтр 70 мкм в свежую коническую пробирку объемом 50 мл для удаления комков. Ресуспензируйте клетки и возьмите образец 10 мкл для подсчета клеток с помощью гемацитометра.
    3. Для генерации эмбриоидных тел (БЭ) 8000-50000 клеток покрываются на лунку 96-луночного планшета со сверхнизким прикреплением (ULA). Рассчитайте общее количество ячеек, необходимых для засеивания 60 лунок 96-луночной пластины ULA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность посева ИПСК может потребовать оптимизации для каждой клеточной линии.
    4. Центрифугирование iPSC в конической среде 15 мл при давлении 200 x g в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость.
    5. Для 480 000 иПСК (8 000 клеток/лунка в 60 лунках) ресуспендирование в 6 мл (100 мкл/лунка в 60 лунках) индукционной среды EB.
    6. Добавьте 150 мкл PBS в 36 внешних лунок 96-луночной пластины ULA с круглым дном.
    7. Повторная суспензия и перенос ИПСК в среде EB в желоб для среды. С помощью многоканальной пипетки добавьте 100 мкл/лунку клеточной суспензии в центр 60 лунок 96-луночного планшета ULA. Периодически ресуспендируйте иПСК в средах БЭ для обеспечения равномерного распределения клеток.
    8. Центрифугируйте 96-луночный планшет при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C (если доступно). Переложите планшеты в инкубатор с температурой 37 °C.
    9. Через 48-72 ч смените 50 мкл среды (половинная смена среды). Проверьте образование кисты через 6 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые линии iPSC формируют EB раньше или легче, чем другие. Следите за формированием БЭ и убедитесь, что БЭ переносятся в нужный момент времени (у них должны развиваться кисты).
  3. Желатиновое покрытие и перенос EB для образования макрофагальных предшественников (день 6-19)
    1. Подготовьте две 6-луночные пластины, покрытые 0,1% желатином. Добавьте 1 мл 0,1% желатина на лунку и выдерживайте при комнатной температуре в течение 20 минут. Отсадите желатиновый раствор и дайте пластинам высохнуть в вытяжке в течение 30-60 минут.
    2. Перенесите БЭ с 96-луночного планшета на 6-луночные планшеты, покрытые желатином, с помощью серологической пипетки объемом 2 мл. Распределите примерно 8-10 EB на лунку 6-луночной пластины, покрытой желатином.
    3. Осторожно удалите остатки EB-среды, использованные при переносе. Добавьте 2 мл питательных сред макрофагов 1 (Mac-CM1) в лунку. Инкубируйте БЭ при температуре 37 °C с 5%СО2 в течение 5-7 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале один 96-луночный планшет с эмбриоидными тельцами может быть разделен на два 6-луночных планшета. Если БЭ развиты слабо, количество переносов БЭ на 6-луночный планшет может быть скорректировано для оптимизации этапа дифференцировки иПСК к эмбриоидному телу.
  4. Генерация макрофагов-предшественников
    1. Заменяйте 2/3 носителя два раза в неделю, увеличивая объем до 3 мл, если цвет носителя меняется.
    2. Проверьте культуры между 8-м и 19-м днями, чтобы определить, готовы ли они к сбору урожая предшественников макрофагов. Если БЭ отделяются, переложите их на свежепокрытую пластину с помощью Mac-CM1 и спокойно инкубируйте в течение 7 дней.
      Примечание: Поддержание комплекса макрофагов-предшественников имеет жизненно важное значение для развития и непрерывного образования макрофагов-предшественников. Оптимизированные макрофагальные прогениторообразующие комплексы будут непрерывно генерировать миелоидные предшественники в течение 2-6+ месяцев.
  5. Сбор урожая миелоидных предшественников (день 19-26+)
    1. Когда в суспензии окажутся клетки-предшественники макрофагов, собирают среду с клетками и переносят в коническую пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте при 200 х г в течение 5 мин и осторожно удалите надосадочную жидкость.
    2. Ресуспендируйте предшественники макрофагов в Mac-CM2 и перенесите в необработанную стерильную чашку/колбу. Инкубировать при 37 °C с 5%CO2 в течение 3-4 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от количества собранных ячеек, переложите в 10-сантиметровую чашку Петри (3-4 лунки из 6-луночной пластины), колбу Т25 (1-2 лунки из 6-луночной пластины) или колбу Т75 (полную 6-луночную пластину) с соответствующим объемом среды. Используйте 5-6 мл среды для колбы T25, 10-12 мл среды в чашке Петри и 12-15 мл среды для колбы T75. Для последующих урожаев миелоидные предшественники и макрофагальные клетки могут быть объединены из предыдущих урожаев, если они принадлежат к одним и тем же линиям/миелоидобразующим комплексам. Просто убедитесь, что колба достаточна для поддержания и питания того количества клеток в колбе (колбах). Макрофаги не размножаются; Они генерируются из предшественников макрофагов. Макрофаги могут быть объединены и поддерживаться в течение 2-6 недель без потери маркеров экспрессии.
  6. Сбор макрофагов
    Примечание: После 14 дней дифференцировки макрофагов в средах Mac-CM2 культуры макрофагов готовы к совместному культивированию или анализу проточной цитометрии.
    1. Соберите отработанную среду и переложите в коническую пробирку объемом 50 мл. Промойте колбу/пластину PBS для удаления остатков среды и клеток.
    2. Добавьте в колбу базовую среду (3 мл для T25 и 5 мл для T75) и с помощью стерильного скребка для клеток отделите клетки от дна колбы/пластины. Переложите ячейки в коническую трубку и при необходимости повторите соскобение.
    3. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Осторожно удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в соответствующих средах или буфере для дальнейшего использования.

4. Совместное культивирование клеток дыхательных путей, эндотелиальных клеток и макрофагов

ПРИМЕЧАНИЕ: Данная процедура описывает этапы совместного культивирования клеток дыхательных путей, эндотелиальных клеток и макрофагов (рис. 1A) с использованием вставок для клеточных культур, адаптированных из Costa et al.12.

  1. Покрытие ЭКМ вкладышей для клеточных культур для ко-культуры (0-й день ко-культуры)
    1. Покрытие клеточной культуры из полиэфира (ПЭТ) порами 3,0 мкм с раствором ЭКМ 4 мг/мл. Кратковременно покройте апикальную сторону вкладышей клеточной культуры внутри планшета 4 мг/мл раствора ЭКМ. Отпишьте остатки раствора ЭХМ. Поместите тарелку в инкубатор на 1 ч при температуре 37 °C.
    2. Получите большую чашку Петри (100 мм x 20 мм или 150 мм x 20 мм). С помощью чистого пинцета стерильно перенесите вставки для клеточных культур из 12-луночного планшета в большую чашку Петри. Переверните вставки так, чтобы базолатеральная сторона была вертикальной.
    3. Смажьте базолатеральную сторону раствором ЭКМ в дозе 4 мг/мл. Отпишьте остатки раствора ЭХМ. Поместите чашку Петри со вставками для клеточных культур с покрытием ECM в инкубатор при температуре 37 °C для сушки на ночь.
  2. Диссоциация и лирование эндотелиальных клеток, полученных из iPSC (1-й день ко-культуры)
    1. Промойте колбу T75 PBS и раствором аспирата. Добавьте 5 мл трипсиноподобной протеазы в колбу T75 и инкубируйте при 37 °C в течение 8 минут. Визуально оцените, что эндотелиальные клетки оторвались от колбы.
      Увеличьте время диссоциации типсиноподобной протеазы, если эндотелиальные клетки, полученные из iPSC, не поднялись из колбы.
    2. Постукивайте колбой, чтобы обеспечить отслоение эндотелиальных клеток и перенести клетки в коническую форму объемом 15 мл. Добавьте 5 мл Stop Media, чтобы остановить диссоциацию. Центрифугируйте ячейки при давлении 300 x g в течение 5 мин.
    3. Аспиратный надосадочный и ресуспензионный клеточный гранул в 1 мл эндотелиальных питательных сред с 10 мкМ ROCKi. Получите 10 мкл ресуспендированного раствора для подсчета клеток и поместите клетки на лед во время подсчета.
    4. Используйте 150 000 iPSC-эндотелиальных клеток на 12 мм клеточную культуральную вставку в 100 мкл эндотелиальных питательных сред. Отрегулируйте соответствующий объем носителя для достижения желаемого количества ячеек на вкладыш.
    5. Получите чашку Петри с вкладышами для клеточных культур размером 3,0 мкм с покрытием ECM из инкубатора (см. шаги 4.1-4.3).
    6. Ресуспендируйте иПСК-эндотелиальные клетки и пипетку 100 мкл со 150 000 клеток на инвертированную вставку для клеточной культуры (базолатеральной стороной вверх). Повторите пипетирование для каждой из подготовленных вставок для клеточных культур
    7. Осторожно перенесите клетки в инкубатор и оставьте их в покое на 3 ч.
    8. В 12-луночный планшет добавьте 1 мл эндотелиальной питательной среды в каждую лунку (для соответствующего количества приготовленных вкладышей для клеточных культур).
    9. Достаньте из инкубатора чашку Петри с эндотелиальными клетками. С помощью чистого пинцета осторожно перенесите вставки для клеточных культур в планшет с эндотелиальными питательными средами (перевернув вставку так, чтобы дно теперь было обращено вниз в среду).
    10. Визуально убедитесь на микроскопе, что эндотелиальные клетки прилипли. Поместите тарелку в инкубатор с температурой 37 °C на ночь.
  3. Диссоциация и осаждение органоидов дыхательных путей, полученных из ИПСК (день 2 совместного культивирования)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к шагам 1.1.1-1.1.15 для выделения органоидов дыхательных путей из полимера ECM. Изменяйте продолжительность диссоциации трипсиноподобной протеазы (шаг 1.1.10) до 15-20 мин для получения одноклеточной суспензии.
    1. Через 15-20 минут остановите реакцию трипсиноподобной протеазы, добавив 3 мл Stop Media. Суспендируйте раствор с помощью пипетки P1000 и центрифугируйте при давлении 400 x g на 5 минут.
    2. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте органоиды дыхательных путей в 1 мл расширяющей среды дыхательных путей с 10 мкМ ROCKi. Возьмите образец объемом 10 мкл для подсчета клеток гемацитометром и поместите клетки на лед во время подсчета.
    3. Засейте 300 000 iPSC-клеток дыхательных путей в 500 мкл среды для расширения дыхательных путей на 12 мм вставку. Отрегулируйте соответствующий объем среды так, чтобы достичь желаемого количества ячеек на подготовленную пластину.
    4. Извлеките планшет со вставками для клеточных культур с эндотелиальными клетками (засеянными с базолатеральной стороны) из инкубатора при температуре 37 °С.
    5. Ресуспендируйте клетки дыхательных путей iPSC и пипетку 500 мкл с 300 000 клеток в апикальную камеру каждой вставки для клеточной культуры. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C на 48 ч вместе с апикальными клетками в условиях жидкость-жидкость.
  4. Сокультура с воздушным лифтингом (День 4 сокультуры)
    1. Удалите среды с апикальной стороны вставки для клеточной культуры. Замените базолатеральную среду на среду для дифференцировки дыхательных путей 1:1 и среду для эндотелиальных культур. Верните тарелку в инкубатор.
  5. Диссоциация и гальванизация макрофагов, полученных из iPSC (5-й день совместного культивирования)
    1. Диссоциируйте макрофаги, полученные из iPSC, из колбы с помощью скребка для клеток (см. шаги 3.22-3.24). Центрифугируйте при 300 х г в течение 5 минут и аспирируйте надосадочную жидкость.
    2. Ресуспендируйте иПСК-макрофаги в 1 мл Mac-CM2. Возьмите образец объемом 10 мкл для подсчета клеток и поместите клетки на лед во время подсчета. Количество макрофагов будет отражать количество засеянных клеток дыхательных путей (соотношение макрофагов и клеток дыхательных путей 1:1).
    3. После подсчета клеток аликвота 300 000 макрофагов в среде объемом 35 мкл на лунку подготовленной клеточной культуры помещается в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Центрифугируйте при 200 х г в течение 5 мин.
    4. После центрифугирования дозируйте надосадочную жидкость. Восстановите суспензию макрофагов в соответствующих Mac-CM2 из расчетов.
    5. Удалите из инкубатора вкладыши с сокультурами эндотелиальных клеток и клеток дыхательных путей. Засейте 300 000 макрофагов в 35 мкл Mac-CM2 на апикальную сторону вставки для клеточной культуры. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C на 48 часов.
      Примечание: Чтобы подтвердить адгезию иммунных клеток iPSC к вставке для клеточной культуры, клетки могут быть помечены флуоресцентным зондом. Подтвердите приверженность флуоресцентному сигналу с помощью микроскопии через 48 ч после нанесения макрофагального покрытия.
  6. Тройная сокультура (День 7 сокультуры)
    1. Убедитесь, что ко-культура готова к последующим применениям, таким как исследования инфекций, измерение трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) и анализ целостности барьера.

Результаты

Существует несколько стадий, на которых дифференцировка органоидов дыхательных путей, эндотелиальных клеток, иммунных клеток и кокультур, полученных из iPSC, может быть оценена как успешно завершенная. Дифференциация может быть выполнена в различных линиях iPSC, и этот ?...

Обсуждение

Разработка и внедрение модели гемато-воздушного барьера в крупных дыхательных путях для изучения вирусных инфекций и других токсинов требуют тщательного внимания к деталям, чтобы обеспечить успешную дифференцировку и функцию различных типов клеток. В ходе этой дис?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Исследование выполнено при поддержке CIRM (DISC2COVID19-12022).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
12 well platesCorning3512
12-well inserts, 0.4 µm, translucent VWR10769-208
2-mercaptoethanol Sigma-AldrichM3148
AccutaseInnovative Cell TechAT104
Activin AR&D Systems338-AC
All-trans retinoic acid (RA) Sigma-AldrichR2625
ascorbic acidSigmaA4544
B27 without retinoic acid ThermoFisher12587010
BMP4 R&D Systems314-BP/CF
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution Gibco15260-037
Br-cAMPSigma-AldrichB5386
CD 14 (FITC)BioLegend982502
CD 31 PECAM-1(APC)R&D SystemFAB3567A
CD 45 (PE)BD Biosciences560975
CD 68 (PE)BioLegend33808
CHIR99021 Abcamab120890
CPMFujifilm014-27501
Dexamethasone Sigma-AldrichD4902
Dispase StemCellTech7913
DMEM/F12 Gibco10565042
DorsomorphinR&D Systems3093
E-CAD/CD 324 (APC)BioLegend324107
EGFR&D Systems236-EG
EGM2 MediumLonzaCC-3162
EPCAM/CD 326 (APC)BioLegend324212
FBS Gibco10082139
FGF10R&D Systems345-FG/CF
FGF7R&D Systems251-KG/CF
FibronectinFisher356008
ForskolinAbcamab120058
Glutamax Life Technologies35050061
Ham’s F12 Invitrogen11765-054
HEPESGibco15630-080
IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)Sigma-AldrichI5879
IL-3Peprotech200-03
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax Invitrogen31980030
Knockout Serum Replacement (KSR)Life Technologies10828028
MatrigelCorning354230
M-CSFPeprotech 300-25
Monothioglycerol SigmaM6145
mTeSR plus Kit (10/case)Stem Cell Tech5825
N2 ThermoFisher17502048
NEAALife Technologies11140050
PBSGibco10010023
Pen/strepLonza17-602F
ReleSRStem Cell Tech5872
RPMI1640 + Glutamax Life Technologies12633012
SB431542 R&D Systems1614
SCFPeproTech300-07
SMAInvitrogen50-9760-80
STEMdiff APEL 2 MediumSTEMCELL Technologies5275
TrypLE ExpressGibco12605-028
VEGF165Preprotech100-20
VimentinCell Signaling5741S
Y-27632 (Rock Inhibitor) R&D Systems1254/1
ZO-1Invitrogen339100

Ссылки

  1. Wu, M., Zhang, X., Lin, Y., Zeng, Y. Roles of airway basal stem cells in lung homeostasis and regenerative medicine. Respir Res. 23 (1), 122 (2022).
  2. Blackburn, J. B., Li, N. F., Bartlett, N. W., Richmond, B. W. An update in club cell biology and its potential relevance to chronic obstructive pulmonary disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 324 (5), L652-L665 (2023).
  3. Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).
  4. Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Ann Am Thorac Soc. 15 (Suppl 3), S143-S148 (2018).
  5. Khalilgharibi, N., Mao, Y. To form and function: On the role of basement membrane mechanics in tissue development, homeostasis and disease. Open Biol. 11 (2), 200360 (2021).
  6. Mcdonald, D. M., Yao, L. C., Baluk, P. Dynamics of airway blood vessels and lymphatics: Lessons from development and inflammation. Proc Am Thorac Soc. 8 (6), 504-507 (2011).
  7. Parker, D., Prince, A. Innate immunity in the respiratory epithelium. Am J Respir Cell Mol Biol. 45 (2), 189-201 (2011).
  8. Davis, J. D., Wypych, T. P. Cellular and functional heterogeneity of the airway epithelium. Mucosal Immunol. 14 (5), 978-990 (2021).
  9. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 210-229 (2011).
  10. Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. Endothelial cells in emerging viral infections. Front Cardiovasc Med. 8, 619690 (2021).
  11. Wang, Y., Zheng, J., Wang, X., Yang, P., Zhao, D. Alveolar macrophages and airway hyperresponsiveness associated with respiratory syncytial virus infection. Front Immunol. 13, 1012048 (2022).
  12. Costa, A., De Souza Carvalho-Wodarz, C., Seabra, V., Sarmento, B., Lehr, C. M. Triple co-culture of human alveolar epithelium, endothelium and macrophages for studying the interaction of nanocarriers with the air-blood barrier. Acta Biomater. 91, 235-247 (2019).
  13. Leibel, S. L., Mcvicar, R. N., Winquist, A. M., Snyder, E. Y. Generation of 3D whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease. J Vis Exp. (170), e62456 (2021).
  14. Mccauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 45 (1), e51 (2018).
  15. Choi, K. -. Y. G., Wu, B. C., Lee, A. H. -. Y., Baquir, B., Hancock, R. E. W. Utilizing organoid and air-liquid interface models as a screening method in the development of new host defense peptides. Front Cell Infect Microbiol. 10, 228 (2020).
  16. Fulcher, M. L., Randell, S. H. Human nasal and tracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture. Methods Mol Biol. 945, 109-121 (2013).
  17. Hao, S., et al. Long-term modeling of SARS-COV-2 infection of in vitro cultured polarized human airway epithelium. mBio. 11 (6), e02852-e02920 (2020).
  18. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 17 (8), 994-1003 (2015).
  19. Van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long-term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PLoS One. 8 (8), e71098 (2013).
  20. Pouyanfard, S., et al. Human-induced pluripotent stem cell-derived macrophages ameliorate liver fibrosis. Stem Cells. 39 (12), 1701-1717 (2021).
  21. Ardini-Poleske, M. E., et al. Lungmap: The molecular atlas of lung development program. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 313 (5), L733-L740 (2017).
  22. Ronaghan, N. J., et al. M1-like, but not m0- or m2-like, macrophages, reduce RSV infection of primary bronchial epithelial cells in a media-dependent fashion. PLoS One. 17 (10), e0276013 (2022).
  23. Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 3 (3), 394-403 (2014).
  24. Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nat Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
  25. Firth, A. L., et al. Generation of multiciliated cells in functional airway epithelia from human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), E1723-E1730 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

214

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены