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Résumé

Cet article décrit la génération d’un modèle complexe de barrière respiratoire multicellulaire composé d’épithélium pulmonaire, de mésenchyme, de cellules endothéliales et de macrophages dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) dans une culture d’interface air-liquide.

Résumé

Le tissu pulmonaire humain est composé d’un réseau interconnecté d’épithélium, de mésenchyme, d’endothélium et de cellules immunitaires allant des voies respiratoires supérieures du nasopharynx au plus petit sac alvéolaire. Les interactions entre ces cellules sont cruciales dans le développement et la maladie pulmonaires, agissant comme une barrière contre les produits chimiques nocifs et les agents pathogènes. Les modèles actuels de co-culture in vitro utilisent des lignées cellulaires immortalisées avec des antécédents biologiques différents, qui peuvent ne pas représenter avec précision le milieu cellulaire ou les interactions pulmonaires. Nous avons différencié les iPSC humaines en organoïdes pulmonaires 3D (contenant à la fois l’épithélium et le mésenchyme), en cellules endothéliales et en macrophages. Ceux-ci ont été co-cultivés dans un format d’interface air-liquide (ALI) pour former une barrière apicale épithéliale/mésenchymateuse investie de macrophages et d’une barrière endothéliale basolatérale (iAirway). iAirways dérivé d’iPSC a montré une réduction de l’intégrité de la barrière en réponse à une infection par des virus respiratoires et des toxines de cigarette. Ce système de co-culture pulmonaire multi-lignées fournit une plate-forme pour étudier les interactions cellulaires, les voies de signalisation et les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement pulmonaire, à l’homéostasie et à la progression de la maladie. Les iAirways imitent étroitement la physiologie humaine et les interactions cellulaires, peuvent être générés à partir d’iPSC dérivées du patient et peuvent être personnalisés pour inclure différents types de cellules des voies respiratoires. Dans l’ensemble, les modèles iAirway dérivés d’iPSC offrent un outil polyvalent et puissant pour étudier l’intégrité de la barrière afin de mieux comprendre les facteurs génétiques de la maladie, la réponse aux agents pathogènes, la régulation immunitaire et la découverte ou la réaffectation de médicaments in vitro, avec le potentiel de faire progresser notre compréhension et notre traitement des maladies des voies respiratoires.

Introduction

La barrière hémato-air dans les grandes voies respiratoires comprend la trachée, les bronches et les bronchioles. Il joue un rôle crucial dans le maintien de la santé respiratoire et est composé de l’épithélium des voies respiratoires, de la membrane basale, des vaisseaux sanguins et des cellules endothéliales, ainsi que des cellules immunitaires. Les cellules épithéliales primaires des voies respiratoires englobent les cellules basales, les cellules massues, les cellules ciliées et les cellules caliciformes. Les cellules basales, agissant comme les cellules souches de l’épithélium des voies respiratoires, sont des progéniteurs multipotents avec des capacités de prolifération et d’auto-renouvellement élevées, donnant naissance à des cellules épithéliales matures des voies respiratoires1. Les cellules club sont des cellules sécrétoires non ciliées qui contribuent au maintien de la muqueuse des voies respiratoires en sécrétant des protéines protectrices et des tensioactifs2. Les cellules caliciformes, situées dans la lumière et dans les glandes sous-muqueuses, sécrètent des mucines pour piéger les débris et protéger les voies respiratoires3. Les cellules ciliées font partie intégrante du mécanisme d’escalade mucociliaire, empêchant l’accumulation de micro-organismes nocifs4. La membrane basale est constituée d’une matrice extracellulaire, qui fournit un support structurel5. La trachée et le reste des voies respiratoires sont entourés d’un riche réseau de vaisseaux sanguins, qui sont tapissés de cellules endothéliales qui jouent un rôle essentiel dans le soutien de la fonction trachéale en fournissant des nutriments et de l’oxygène, en éliminant les déchets, en régulant l’inflammation et en contribuant à la réparation des tissus et à l’angiogenèse6. Enfin, les macrophages des voies respiratoires sont des cellules immunitaires spécifiques aux tissus, essentielles pour protéger le système respiratoire contre les infections, éliminer les particules inhalées et maintenir une réponse immunitaire équilibrée7.

L’action coordonnée des cellules épithéliales, mésenchymateuses, endothéliales et macrophages est essentielle pour une réponse immunitaire efficace aux agents pathogènes dans les voies respiratoires8. Les cellules épithéliales forment la première ligne de défense contre les infections virales en agissant comme une barrière physique, avec des jonctions serrées limitant le passage des substances nocives. L’action coordonnée des cellules ciliées et des cellules caliciformes aide à piéger et à éliminer les particules inhalées, les agents pathogènes et les débris4. De plus, les cellules épithéliales des voies respiratoires produisent des cytokines et des chimiokines pour recruter des cellules immunitaires9. Les cellules endothéliales maintiennent l’intégrité vasculaire, empêchant la propagation des particules virales dans la circulation sanguine, régulent à la hausse les molécules d’adhésion (VCAM-1) pour faciliter l’adhésion des cellules immunitaires et produisent des cytokines pro-inflammatoires pour recruter les cellules immunitaires de la circulation sanguine vers le site de l’infection10. Les macrophages des voies respiratoires engloutissent et digèrent les particules virales, les cellules infectées et les débris, présentent des antigènes viraux aux lymphocytes T et produisent des cytokines pour activer et recruter d’autres cellules immunitaires, ainsi que des interférons de type I pour inhiber la réplication virale11. L’action coordonnée des cellules épithéliales, mésenchymateuses, endothéliales et macrophages crée un système de défense robuste et dynamique qui protège les voies respiratoires contre les infections virales et maintient la santé respiratoire.

Comprendre les interactions dynamiques entre les différents types de cellules du poumon humain est crucial pour comprendre la réponse du poumon aux infections virales, aux maladies inflammatoires et à l’administration de médicaments. Les co-cultures in vitro permettent d’étudier la signalisation cellule-cellule entre l’épithélium, les cellules endothéliales et les cellules immunitaires innées12. Nous avons développé le premier modèle pulmonaire authentique de type multicellulaire dérivé d’hiPSCs spécifiques au patient13. Celui-ci intègre à la fois des populations de cellules épithéliales et mésenchymateuses, formées dans une orientation 3D. Par la suite, les cellules progénitrices pulmonaires peuvent être différenciées en un « organoïde des voies respiratoires »14, cultivées sur des inserts de culture cellulaire stériles et exposées à une interface air-liquide (ALI), reproduisant les conditions des voies respiratoires humaines 15,16,17. Les cellules endothéliales dérivées d’iPSC sont cultivées sur le côté basolatéral de la membrane, imitant leur orientation dans les voies respiratoires humaines, situées sous la couche épithéliale/mésenchymateuse de la membrane basale. Enfin, des macrophages dérivés d’iPSC sont ajoutés à la face apicale de la membrane, interagissant avec les cellules épithéliales et attendant les signaux d’activation (Figure 1A). Ce modèle reproduit avec précision la biologie et la fonction des voies respiratoires. Nous postulons que les cultures iAirway authentiques de type multicellulaire dérivées d’hiPSC, spécifiques au patient et les mieux adaptées pour élucider la réponse aiguë intrinsèque de la barrière des voies respiratoires et des agents pathogènes, y compris les infections virales. Par exemple, ce modèle peut être utilisé pour (1) étudier l’entrée et la réplication virales, (2) étudier la réponse immunitaire initiale des cellules immunitaires épithéliales et tissulaires spécifiques, (3) examiner l’intégrité et la fonction de la barrière, (4) tester l’efficacité des agents thérapeutiques et (5) étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la pathogenèse dans un modèle spécifique au patient.

Cet article décrit un protocole détaillé pour la préparation de co-cultures pulmonaires multicellulaires afin d’étudier les réponses cellulaires aux infections virales.

Protocole

Ce protocole d’étude a été approuvé par le comité d’examen institutionnel du programme de protection de la recherche humaine de l’UCSD (181180). Ce protocole utilise de petites molécules et des facteurs de croissance pour diriger la différenciation des cellules souches pluripotentes en cellules des voies respiratoires, cellules endothéliales et macrophages. Ces cellules sont ensuite co-cultivées sur des inserts de culture cellulaire et polarisées dans une interface air-liquide. Les détails des réactifs, des consommables et de l’équipement utilisés sont répertoriés dans la table des matériaux. Les compositions des milieux et des tampons sont fournies dans le Fichier supplémentaire 1.

1. Génération d’organoïdes des voies respiratoires dérivés d’iPSC (jours 1 à 30)

REMARQUE : Ce protocole décrit les étapes requises pour générer des organoïdes des voies respiratoires dérivés d’iPSC (figure 1B), selon la méthodologie décrite dans Leibel et al.13. Le processus comprend l’induction de l’endoderme définitif (jours 1 à 3), la génération de l’endoderme antérieur de l’intestin antérieur (jours 4 à 6) et la différenciation en progéniteurs pulmonaires (jours 7 à 16). La méthodologie détaillée se trouve dans la publication précédente13. Les étapes suivantes détaillent la génération d’organoïdes des voies respiratoires à partir des progéniteurs pulmonaires.

  1. Extraction et dissociation des sphéroïdes progéniteurs pulmonaires à partir d’un polymère ECM (jour 17)
    1. Décongeler le polymère de la matrice extracellulaire (MEC) (8-9 mg/mL) sur de la glace.
    2. Aspirer des milieux usés, à l’aide d’un aspirateur, à partir d’organoïdes pulmonaires intégrés dans la MEC.
      REMARQUE : Pour les étapes d’aspiration suivantes, utilisez un aspirateur à vide, sauf indication contraire.
    3. Ajoutez 1 mL de dispase à 2 U/mL complétée par 10 μM d’inhibiteur de ROCK1 (ROCKi) dans les cellules et utilisez une pipette P1000 pour remettre manuellement en suspension les progéniteurs pulmonaires dans la MEC. Incuber pendant 30 min à 37 °C, en remettant le mélange en suspension toutes les 15 minutes pour améliorer l’efficacité de la dissociation des dispases grâce à un traitement mécanique.
    4. 15 min avant l’utilisation, placez 45 ml de PBS à température ambiante dans un congélateur à -20 °C pour refroidir. Assurez-vous que le PBS est inférieur à 4 °C pour une dépolymérisation ECM optimale dans les étapes suivantes.
    5. Après 30 min d’incubation de la dispase, transférez l’organoïde et la solution de dispase dans un tube conique de 15 ml.
    6. Ajouter du PBS réfrigéré (2 mL par 1 mL de protéase) pour laver et recueillir les restes d’organoïdes et de MEC de la plaque. Remettre les organoïdes en suspension à l’aide d’une pipette P1000 et centrifuger à 400 x g pendant 5 min.
      REMARQUE : Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées à température ambiante, sauf indication contraire dans ce protocole.
    7. Après centrifugation, une pastille ECM trouble avec des organoïdes devrait être visible. Aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette, en évitant la pastille ECM.
    8. Effectuez un deuxième lavage PBS avec du PBS réfrigéré, remettez en suspension à l’aide d’une pipette P1000 et centrifugez à 400 x g pendant 5 min. Aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette, en laissant ~100 μL de solution résiduelle.
    9. Ajoutez 2 ml de protéase semblable à la trypsine aux organoïdes dans le tube conique de 15 ml. Remettre en suspension à l’aide d’une pipette P1000. Incuber pendant 10 à 12 minutes à 37 °C, en inversant ou en retournant le tube pour remettre le mélange en suspension à mi-chemin de l’incubation.
      REMARQUE : Effectuez 10 à 12 minutes de dissociation de la protéase de type trypsine pour faire passer les organoïdes sous forme d’agrégats.
    10. Après 12 min, arrêtez la réaction de protéase de type trypsine en ajoutant 2 mL de FBS à 2 % dans le milieu de base (Stop Media, voir le fichier supplémentaire 1). Remettre la solution en suspension à l’aide d’une pipette P1000 et centrifuger à 400 x g pendant 5 min.
    11. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les organoïdes dans les milieux d’arrêt complétés par 10 μM de ROCKi. Prélever un échantillon de 10 μL pour le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et de bleu trypan. Gardez les organoïdes sur de la glace pendant le dénombrement.
    12. Calculez le volume nécessaire pour obtenir 100 000 cellules par puits. La cellule aliquote s’agrège dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et centrifuge pendant 5 min à 400 x g. Éliminer l’excès de surnageant, en laissant 10 μL de milieu résiduel.
    13. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 200 μL de polymère ECM froid (éviter les bulles et agir rapidement pour éviter une polymérisation prématurée). Ajouter 200 μL du mélange ECM et cellule au fond de chaque puits dans une plaque de 12 puits. Laisser l’ECM polymériser partiellement à température ambiante dans l’enceinte de biosécurité pendant 5 min.
    14. Transférez la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 30 à 60 minutes pour terminer la polymérisation ECM. Ensuite, ajoutez 1,5 mL de milieu d’induction organoïde des voies respiratoires (Fichier supplémentaire 1).
    15. Changez de milieu tous les deux jours pendant 14 jours jusqu’au jour 30. Si le milieu jaunit dans les 24 heures, augmentez le volume à 2 ml.

2. Génération de cellules endothéliales dérivées d’iPSC (jours 1 à 14)

REMARQUE : La procédure suivante détaille la génération de cellules endothéliales à partir d’iPSC (Figure 1C), adaptée de Patsch et al.18. Cette méthode comprend la préparation des plaques, la différenciation des iPSC, l’induction, le tri et l’expansion des cellules endothéliales. Le tableau 1 énumère les anticorps utilisés dans cette étude.

  1. Placage des iPSC pour la différenciation endothéliale (Jour 0)
    1. Commencer la différenciation des cellules endothéliales lorsque les hiPSC atteignent une confluence de 70 à 80 %. Ajouter 10 μM de ROCKi Y-27632 dans chaque puits une heure avant la dissociation.
    2. Aspirer le milieu, laver les puits avec 1 mL de PBS puis dissocier les iPSC en ajoutant 1 mL de solution de détachement cellulaire par puits d’une plaque à 12 puits. Incuber pendant 20 min à 37 °C.
    3. Neutralisez la solution de décollement cellulaire en ajoutant 2 mL de milieu d’arrêt dans les puits. Pipette pour obtenir une suspension unicellulaire. Transférez les cellules dans un tube conique de 15 mL et centrifugez pendant 5 min à 300 x g.
    4. Aspirer le surnageant, remettre en suspension les iPSC dans des milieux de culture iPSC complétés par 10 μM de ROCKi, et effectuer une numération cellulaire. Plaque 100 000 hiPSC par puits d’une plaque de 12 puits revêtue d’ECM dans 1 mL de milieu de culture iPSC avec 10 μM de ROCKi. Incuber toute la nuit à 37 °C.
      REMARQUE : La densité d’ensemencement pour la différenciation iPSC-endothélial peut nécessiter une optimisation par lignée cellulaire. Évaluez l’efficacité de la différenciation à l’aide de la cytométrie en flux pour CD31 le jour 6.
  2. Induction latérale du mésoderme (jours 1-3)
    1. Aspirer un milieu de culture de CSPi à partir de CSPi en plaques et ajouter 3 mL de milieu de base N2B27 complété par 6 μM de CHIR et 25 ng/mL de BMP4 par puits (Fichier supplémentaire 1). Réchauffez le média avant de l’ajouter aux cellules. Ne changez pas de support pendant 3 jours.
  3. Induction des cellules endothéliales (jours 4-5)
    1. Le jour 4, aspirer le milieu N2B27 et ajouter 2 ml de milieu de différenciation endothéliale (EDM) complété par 200 ng/mL de VEGF165 et 2 μM de forskoline par puits. Changez de média le jour 5.
  4. Tri et replacage des cellules endothéliales (Jour 6)
    1. Le jour 5 ou 6, préparez une fiole T75 enrobée de fibronectine pour l’enrichissement par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) en reconstituant 1 mg de fibronectine dans de l’eau stérile pour obtenir une solution de fibronectine de 100 μg/mL. Enduire le ballon T75 de 6 mL de solution de fibronectine et incuber à température ambiante pendant une heure. Aspirez la solution de fibronectine et lavez-la à l’eau stérile. Laissez sécher la fiole T75 à température ambiante. Les flacons supplémentaires fabriqués peuvent être conservés à 4 °C.
    2. Préparer les milieux d’entretien endothéliale (EMM)18.
    3. Au jour 6, enrichissez les cellules endothéliales dérivées d’iPSC via FACS à l’aide de l’anticorpsCD31 18.
    4. Ajouter 10 μM de ROCKi Y-27632 dans chaque puits une heure avant la dissociation à 37 °C. Aspirez le milieu et lavez-le avec du PBS. Ajouter 1 mL de solution de détachement cellulaire préchauffée par puits d’une plaque de 12 puits et incuber pendant 8 à 10 minutes à 37 °C.
    5. Pipeter doucement pour assurer le détachement d’une seule cellule. Transférez les cellules dans un tube conique de 15 ml et ajoutez un volume égal de milieu d’arrêt. Centrifugeuse pendant 5 min à 300 x g.
    6. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules endothéliales dans 1 mL de milieu d’arrêt complété par 10 μM de ROCKi.  Faites passer les cellules à travers un filtre de 70 μm en ajoutant d’abord 1 ml de média d’arrêt pour mouiller le filtre, puis pipetez les cellules à travers le filtre. Prélever un échantillon de 10 μL pour le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre et de bleu trypan. Gardez les cellules sur la glace pendant le dénombrement.
    7. Effectuez un comptage cellulaire. Préparez une aliquote de 200 000 cellules comme témoin négatif non coloré. Transférez les cellules restantes dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et ajoutez 10 μL de CD31-APC pour 1 million de cellules dans 100 μL de tampon FACS. Incuber pendant 30 min sur un rotateur à 4 °C.
    8. Une fois l’incubation terminée, centrifugez le tube d’Eppendorf avec les cellules pendant 5 min à 300 x g, lavez les cellules en ajoutant 1 ml de PBS. Répétez deux fois l’étape de lavage et de centrifugation. Retirez manuellement le surnageant entre les lavages.
    9. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de tampon FACS et 5 ug/mL de solution DAPI pour la coloration de viabilité, 5 minutes avant le tri. Tri selon les directives institutionnelles.
    10. Recueillir les cellules triées par FACS dans un tube conique de 15 mL avec 2 mL d’EMM. Centrifuger le tube conique de 15 ml avec des cellules pendant 5 min à 300 x g. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules endothéliales dans 10 mL d’EMM complété par 10 μM de ROCKi Y-27632 et de pénicilline streptomycine (1 %).
    11. Transférez les cellules endothéliales dérivées d’iPSC enrichies en FACS dans le ballon enrobé de fibronectine. Répartissez uniformément les cellules et placez-les dans un incubateur à 37 °C pendant la nuit.
      REMARQUE : Utilisez un minimum de 500 000 cellules et un maximum de 2 000 000 cellules par fiole T75.
  5. Expansion et cryoconservation de cellules endothéliales triées (Jour 7+)
    1. Changez le support EMM tous les 2-3 jours après l’enrichissement FACS. Une fois que le ballon T75 devient confluent (environ 7 jours après le FACS, en fonction de la densité d’ensemencement), les cellules endothéliales dérivées d’iPSC peuvent être utilisées pour la co-culture ou cryoconservées pour des applications futures.
    2. Préparer une solution de congélation endothéliale 2x avant la dissociation cellulaire (80 % Endo-CM2, 20 % DMSO, 20 μM de ROCKi).
    3. Étiquetez les tubes cryogéniques dans un stylo résistant à l’éthanol avec les informations correspondantes. ID de la ligne, numéro de passage, milieu de culture, « décongélation dans un 6 puits », date de gel.
    4. Lorsque les cellules endothéliales dérivées d’iPSC triées sont confluentes, amorcer la dissociation.
    5. Laver la fiole T75 avec 5 ml de PBS -/-.
    6. Dissocier les cellules endothéliales dérivées d’iPSC avec 5 ml de protéase de type trypsine par T75. Incuber les cellules à 37 °C PENDANT 10 min, en vérifiant périodiquement le T75 pour vérifier que les cellules se sont soulevées.
    7. Neutralisez la réaction en ajoutant 5 mL de milieu d’arrêt. Transvasez 10 ml de cellules en solution dans un tube de 15 ml. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min.
    8. Aspirez le surnageant, mettez à nouveau en suspension les cellules endothéliales dans un milieu E-CBM et prélevez un échantillon de 10 μL pour le comptage à l’aide d’un hémacytomètre.
    9. Après numération cellulaire, aliquote 1 million de cellules par 0,5 mL de milieu EGM2.
      REMARQUE : L’étape suivante est sensible au temps. Préparez les cryoflacons et les récipients de congélation à utiliser immédiatement.
    10. Aliquote volume égal de solution de congélation 2x aux cellules endothéliales. La concentration finale est de 90 % d’Endo-CM2, 10 % de DMO et 10 μM de ROCKi (1 mL/1 million de cellules).
    11. Transférez immédiatement les flacons bouchés dans une chambre de congélation et placez-les à -80 °C pendant la nuit, puis dans de l’azote liquide (-180 °C) le lendemain pour un stockage à long terme.

3. Génération de macrophages dérivés d’iPSC (Jour 1 - 26)

REMARQUE : Cette procédure décrit les étapes de génération de macrophages à partir d’iPSC (Figure 1D), adaptée de van Wilgenburg et al.19 et de Pouyanfard et al.20. Il couvre l’adaptation unicellulaire des iPSC, la différenciation des corps embryoïdes, la formation des progéniteurs des macrophages et la maturation des macrophages.

  1. Adaptation unicellulaire d’iPSC
    1. Lorsque les iPSC atteignent une confluence de ~70 % à 90 % sans signes visibles de différenciation, commencer le passage unicellulaire avec une protéase de type trypsine.
    2. Aspirez le support usagé et rincez-le avec du PBS. Retirer le PBS et ajouter de la protéase semblable à la trypsine (1 ml/puits d’une plaque à 6 puits, 500 μL/puits d’une plaque à 12 puits). Incuber à 37 °C pendant 2 à 5 minutes jusqu’à ce que les colonies d’iPSC se dissocient de la plaque.
    3. Neutraliser la protéase de type trypsine avec un volume égal de milieu stop (1 ml/puits d’une plaque à 6 puits, 500 μL/puits d’une plaque à 12 puits). Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min.
    4. Aspirez le surnageant et remettez doucement en suspension les cellules dans des milieux de culture iPSC avec 10 μM de ROCKi. Passage sur de nouvelles plaques revêtues d’ECM. Répétez l’opération pendant 2-3 passages avant de cryoconserver ou d’utiliser les iPSC adaptées à une seule cellule.
      REMARQUE : Ajustez le rapport de passage de 1:2 à 1:10 en fonction de la santé et de l’adaptation des cellules. De plus, les iPSC qui ont subi au moins trois passages unicellulaires et qui sont à faible passage produisent des différenciations macrophages optimales.
  2. Formation du corps embryoïde (jours 0-6)
    1. Lorsque les iPSC adaptées à une seule cellule atteignent une confluence de ~75 %, les iPSC sont acheminées avec une protéase de type trypsine conformément aux étapes 3.1 à 3.4.
    2. Remettre les cellules en suspension dans le milieu d’arrêt et les passer à travers une crépine de 70 μm dans un tube conique frais de 50 mL pour éliminer les grumeaux. Remettre les cellules en suspension et prélever un échantillon de 10 μL pour le comptage des cellules à l’aide d’un hémacytomètre.
    3. Pour la génération de corps embryoïde (EB), 8 000 à 50 000 cellules sont plaquées par puits d’une plaque à très faible fixation (ULA) à 96 puits. Calculez le nombre total de cellules nécessaires pour ensemencer 60 puits d’une plaque ULA de 96 puits.
      REMARQUE : La densité d’ensemencement des CSPi peut nécessiter une optimisation par lignée cellulaire.
    4. Centrifugeuse iPSC en 15 mL conique à 200 x g pendant 5 min. Aspirez le surnageant.
    5. Pour 480 000 iPSC (8 000 cellules/puits dans 60 puits), remettre en suspension dans un milieu à induction EB de 6 mL (100 ul/puits dans 60 puits).
    6. Ajoutez 150 μL de PBS dans les 36 puits extérieurs d’une plaque ULA à fond rond de 96 puits.
    7. Résuspendez et transférez les iPSC dans les supports EB vers une auge de supports. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 100 μL/puits de suspension cellulaire dans les 60 puits centraux de la plaque ULA à 96 puits. Remettre en suspension les iPSC dans les milieux EB par intermittence pour assurer une distribution uniforme des cellules.
    8. Centrifuger la plaque à 96 puits à 300 x g pendant 5 min à 4 °C (si disponible). Transvaser les plaques dans un incubateur à 37 °C.
    9. Après 48-72 h, changer 50 μL du média (changement de demi-média). Vérifiez la formation de kystes après 6 jours.
      REMARQUE : Certaines lignées iPSC forment des EB plus tôt ou plus facilement que d’autres. Surveillez la formation d’EB et assurez-vous que les EB sont transférés au moment approprié (ils devraient développer des kystes).
  3. Enrobage de gélatine et transfert d’EB pour la formation de progéniteurs de macrophages (jours 6 à 19)
    1. Préparez deux plaques à 6 puits recouvertes de gélatine à 0,1 %. Ajouter 1 mL de gélatine à 0,1 % par puits et incuber à température ambiante pendant 20 min. Aspirez la solution de gélatine et laissez les plaques sécher dans la hotte pendant 30 à 60 min.
    2. Transférez les EB de la plaque à 96 puits vers les plaques à 6 puits recouvertes de gélatine à l’aide d’une pipette sérologique de 2 mL. Répartissez environ 8 à 10 EB par puits d’une plaque recouverte de gélatine à 6 puits.
    3. Retirez avec précaution les résidus de fluide EB utilisés lors du transfert. Ajouter 2 mL de milieu de culture de macrophages 1 (Mac-CM1) par puits. Incuber les EB sans être dérangés à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 5 à 7 jours.
      REMARQUE : Idéalement, une plaque de 96 puits de corps embryoïdes peut être divisée en deux plaques de 6 puits. Si les EB sont peu développés, le nombre d’EB transférés par plaque à 6 puits peut être ajusté pour optimiser l’étape de différenciation des iPSC en corps embryoïdes.
  4. Génération de progéniteurs de macrophages
    1. Remplacez les 2/3 du support deux fois par semaine, en augmentant le volume à 3 ml si la couleur du support change.
    2. Vérifiez les cultures entre les jours 8 et 19 pour déterminer si elles sont prêtes pour la récolte des progéniteurs de macrophages. Si les EB se détachent, transférez-les dans une plaque fraîchement enduite de Mac-CM1 et incubez sans être dérangés pendant 7 jours.
      REMARQUE : Le maintien du complexe formation des progéniteurs des macrophages est vital pour le développement et la génération continue des progéniteurs des macrophages. Des complexes optimisés de formation de progéniteurs de macrophages généreront continuellement des progéniteurs myéloïdes pendant 2 à 6+ mois.
  5. Prélèvement des progéniteurs myéloïdes (jours 19-26+)
    1. Lorsqu’il y a des cellules progénitrices de macrophages en suspension, récoltez le milieu avec les cellules et transférez-le dans un tube conique de 50 ml. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min et retirer délicatement le surnageant.
    2. Remettre en suspension les progéniteurs de macrophages dans Mac-CM2 et transférer dans une boîte/fiole de culture stérile non traitée. Incuber à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 3-4 jours.
      REMARQUE : Selon le nombre de cellules prélevées, transvaser dans une boîte de Pétri de 10 cm (3 à 4 puits d’une plaque à 6 puits), une fiole T25 (1 à 2 puits d’une plaque à 6 puits) ou une fiole T75 (plaque pleine à 6 puits) avec le volume de milieu approprié. Utiliser 5 à 6 ml de milieu pour une fiole T25, 10 à 12 ml de milieu dans une boîte de Pétri et 12 à 15 ml de milieu pour une fiole T75. Pour les récoltes ultérieures, les progéniteurs myéloïdes et les cellules macrophages peuvent être regroupés à partir des récoltes précédentes s’ils proviennent de la même lignée/complexe myéloïde formant. Assurez-vous simplement que le ballon est suffisant pour maintenir et alimenter le nombre de cellules dans le(s) flacon(s). Les macrophages ne prolifèrent pas ; Ils sont générés à partir de progéniteurs de macrophages. Les macrophages peuvent être regroupés et maintenus pendant 2 à 6 semaines sans perdre de marqueurs d’expression.
  6. Récolte des macrophages
    REMARQUE : Après 14 jours de différenciation des macrophages dans les milieux Mac-CM2, les cultures de macrophages sont prêtes pour la co-culture ou l’analyse par cytométrie en flux.
    1. Recueillir les supports usagés et les transférer dans un tube conique de 50 ml. Rincez le ballon/la plaque avec du PBS pour éliminer les résidus de milieu et les cellules.
    2. Ajouter le milieu de base dans le ballon (3 mL pour le T25 et 5 mL pour le T75) et détacher les cellules du fond du ballon ou de la plaque à l’aide d’un grattoir stérile. Transférez les cellules dans un tube conique et répétez le grattage si nécessaire.
    3. Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min à température ambiante. Retirez soigneusement le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un milieu ou un tampon approprié pour une utilisation ultérieure.

4. Co-culture de cellules des voies respiratoires, de cellules endothéliales et de macrophages

REMARQUE : Cette procédure décrit les étapes de la co-culture de cellules des voies respiratoires, de cellules endothéliales et de macrophages (Figure 1A) à l’aide d’inserts de culture cellulaire, adaptés de Costa et al.12.

  1. Revêtement ECM d’inserts de culture cellulaire pour la co-culture (Jour 0 de la co-culture)
    1. Enduire les inserts de culture cellulaire en polyester (PET) à pores de 3,0 μm avec une solution ECM de 4 mg/mL. Enduire brièvement la face apicale des inserts de culture cellulaire à l’intérieur de la plaque avec 4 mg/mL de solution ECM. Pipeter la solution résiduelle ECM. Placez la plaque dans l’incubateur pendant 1 h à 37 °C.
    2. Procurez-vous une grande boîte de Pétri (100 mm x 20 mm ou 150 mm x 20 mm). À l’aide d’une pince à épiler propre, transférez stérilement les inserts de culture cellulaire de la plaque à 12 puits dans la grande boîte de Pétri. Retournez les inserts de manière à ce que le côté basolatéral soit droit.
    3. Enduire la face basolatérale d’une solution ECM à 4 mg/mL. Pipeter la solution résiduelle ECM. Placez la boîte de Pétri avec les inserts de culture cellulaire recouverts d’ECM dans un incubateur à 37 °C pour qu’elle sèche pendant la nuit.
  2. Dissociation et mise en plaques de cellules endothéliales dérivées d’iPSC (Jour 1 de la co-culture)
    1. Lavez la fiole T75 avec du PBS et aspirez la solution. Ajouter 5 mL de protéase semblable à la trypsine dans la fiole T75 et incuber à 37 °C pendant 8 min. Évaluer visuellement que les cellules endothéliales se sont soulevées du flacon.
      REMARQUE : Augmentez le temps de dissociation de la protéase de type typsine si les cellules endothéliales dérivées de l’iPSC ne se sont pas soulevées du flacon.
    2. Tapoter le ballon pour assurer le détachement des cellules endothéliales et transférer les cellules dans un cône de 15 ml. Ajouter 5 mL de Stop Media pour arrêter la dissociation. Cellules de centrifugation à 300 x g pendant 5 min.
    3. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu de culture endothéliale avec 10 μM de ROCKi. Obtenez 10 μL de solution remise en suspension pour le comptage des cellules et placez les cellules sur de la glace pendant le comptage.
    4. Utiliser 150 000 cellules endothéliales iPSC par insert de culture cellulaire de 12 mm dans 100 μL de milieu de culture endothéliale. Ajustez le volume du support correspondant pour atteindre le nombre souhaité de cellules par insertion.
    5. Procurez-vous une boîte de Pétri avec des inserts de culture cellulaire de 3,0 μm recouverts d’ECM dans l’incubateur (voir les étapes 4.1 à 4.3).
    6. Remettre en suspension les cellules endothéliales iPSC et pipeter 100 μL avec 150 000 cellules sur l’insert de culture cellulaire inversé (côté basolatéral vers le haut). Répétez le pipetage pour chacun des inserts de culture cellulaire préparés
    7. Transférez soigneusement les cellules dans l’incubateur et laissez-les tranquilles pendant 3 h.
    8. Dans une plaque à 12 puits, ajouter 1 mL de milieu de culture endothéliale dans chaque puits (pour le nombre respectif d’inserts de culture cellulaire préparés).
    9. Sortez la boîte de Pétri avec les cellules endothéliales de l’incubateur. À l’aide d’une pince à épiler propre, transférez soigneusement les inserts de culture cellulaire dans la plaque avec le milieu de culture endothéliale (en retournant l’insert de sorte que le bas soit maintenant orienté vers le bas dans le milieu).
    10. Vérifiez visuellement au microscope que les cellules endothéliales avaient adhéré. Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant la nuit.
  3. Dissociation et placage d’organoïdes des voies respiratoires dérivés d’iPSC (Jour 2 de la co-culture)
    REMARQUE : Reportez-vous aux étapes 1.1.1 à 1.1.15 pour l’isolement des organoïdes des voies respiratoires du polymère ECM. Modifier la durée de dissociation de la protéase de type trypsine (étape 1.1.10) à 15-20 min pour obtenir une suspension unicellulaire.
    1. Après 15 à 20 min, arrêtez la réaction de protéase de type trypsine en ajoutant 3 ml de Stop Media. Remettre la solution en suspension à l’aide d’une pipette P1000 et centrifuger à 400 x g pendant 5 min.
    2. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les organoïdes des voies respiratoires dans un milieu d’expansion des voies respiratoires de 1 mL avec 10 μM de ROCKi. Prélever un échantillon de 10 μL pour le numération cellulaire de l’hémacytomètre et placer les cellules sur de la glace pendant le comptage.
    3. Ensemencez 300 000 cellules iPSC-voies respiratoires dans 500 μL de milieu d’expansion des voies respiratoires par insert de culture cellulaire de 12 mm. Ajustez le volume du support respectif pour atteindre le nombre souhaité de cellules par insert préparé.
    4. Retirer la plaque avec des inserts de culture cellulaire avec des cellules endothéliales (ensemencées sur le côté basolatéral) de l’incubateur à 37 °C.
    5. Remettre en suspension les cellules des voies respiratoires iPSC et pipeter 500 μL avec 300 000 cellules dans la chambre apicale de chaque insert de culture cellulaire. Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 48 h avec les cellules apicales dans des conditions liquide-liquide.
  4. Co-culture de transport aérien (Jour 4 de la co-culture)
    1. Retirer le milieu de la face apicale de l’insert de culture cellulaire. Remplacer les milieux basolatéraux par des milieux de différenciation des voies respiratoires 1:1 et des milieux de culture endothéliale. Remettez la plaque dans l’incubateur.
  5. Dissociation et mise en boîte de macrophages dérivés d’iPSC (Jour 5 de la co-culture)
    1. Dissocier les macrophages dérivés d’iPSC du ballon à l’aide d’un racleur cellulaire (voir les étapes 3.22 à 3.24). Centrifuger à 300 x g pendant 5 min et aspirer le surnageant.
    2. Mettez en suspension les macrophages iPSC dans 1 mL de Mac-CM2. Prélever un échantillon de 10 μL pour le comptage des cellules et placer les cellules sur de la glace pendant le comptage. Le nombre de macrophages correspondra au nombre de cellules des voies respiratoires ensemencées (rapport 1:1 entre les macrophages et les cellules des voies respiratoires).
    3. Après le comptage cellulaire, aliquote 300 000 macrophages dans un milieu de 35 μL par puits d’inserts de culture cellulaire préparés dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min.
    4. Après la centrifugation, pipeter le surnageant. Suspendez à nouveau les macrophages dans le Mac-CM2 respectif des calculs.
    5. Retirer de l’incubateur les inserts contenant des co-cultures de cellules endothéliales et des voies respiratoires. Ensemencez 300 000 macrophages dans 35 μL de Mac-CM2 sur la face apicale de l’insert de culture cellulaire. Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 48 h.
      REMARQUE : Pour confirmer l’adhérence des cellules immunisées aux iPSC à l’insert de culture cellulaire, les cellules peuvent être marquées à l’aide d’une sonde fluorescente. Confirmer l’observance par microscopie pour le signal fluorescent 48 h après le placage des macrophages.
  6. Triple co-culture (Jour 7 de co-culture)
    1. Assurez-vous que la co-culture est prête pour les applications en aval telles que les études d’infection, les mesures de résistance électrique transépithéliale (TEER) et les tests d’intégrité de la barrière.

Résultats

Il existe plusieurs étapes auxquelles la différenciation des organoïdes des voies respiratoires, des cellules endothéliales, des cellules immunitaires et des co-cultures dérivées d’iPSC peut être évaluée comme étant menée à bien. Les différenciations peuvent être effectuées dans différentes lignées iPSC, et ce protocole a été testé dans au moins cinq lignées différentes. Le protocole doit être adapté à chaque nouvelle ligne iPSC, notamment en modifiant et en op...

Discussion

Le développement et la mise en œuvre d’un modèle de la barrière hémato-air dans les grandes voies respiratoires pour l’étude des infections virales et d’autres toxines nécessitent une attention méticuleuse aux détails pour assurer la différenciation et la fonction réussies des différents types de cellules impliqués. Cette discussion abordera les facteurs clés d’une différenciation réussie, les défis potentiels, les applications alternatives et les implications po...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par le CRIEM (DISC2COVID19-12022).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
12 well platesCorning3512
12-well inserts, 0.4 µm, translucent VWR10769-208
2-mercaptoethanol Sigma-AldrichM3148
AccutaseInnovative Cell TechAT104
Activin AR&D Systems338-AC
All-trans retinoic acid (RA) Sigma-AldrichR2625
ascorbic acidSigmaA4544
B27 without retinoic acid ThermoFisher12587010
BMP4 R&D Systems314-BP/CF
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution Gibco15260-037
Br-cAMPSigma-AldrichB5386
CD 14 (FITC)BioLegend982502
CD 31 PECAM-1(APC)R&D SystemFAB3567A
CD 45 (PE)BD Biosciences560975
CD 68 (PE)BioLegend33808
CHIR99021 Abcamab120890
CPMFujifilm014-27501
Dexamethasone Sigma-AldrichD4902
Dispase StemCellTech7913
DMEM/F12 Gibco10565042
DorsomorphinR&D Systems3093
E-CAD/CD 324 (APC)BioLegend324107
EGFR&D Systems236-EG
EGM2 MediumLonzaCC-3162
EPCAM/CD 326 (APC)BioLegend324212
FBS Gibco10082139
FGF10R&D Systems345-FG/CF
FGF7R&D Systems251-KG/CF
FibronectinFisher356008
ForskolinAbcamab120058
Glutamax Life Technologies35050061
Ham’s F12 Invitrogen11765-054
HEPESGibco15630-080
IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)Sigma-AldrichI5879
IL-3Peprotech200-03
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax Invitrogen31980030
Knockout Serum Replacement (KSR)Life Technologies10828028
MatrigelCorning354230
M-CSFPeprotech 300-25
Monothioglycerol SigmaM6145
mTeSR plus Kit (10/case)Stem Cell Tech5825
N2 ThermoFisher17502048
NEAALife Technologies11140050
PBSGibco10010023
Pen/strepLonza17-602F
ReleSRStem Cell Tech5872
RPMI1640 + Glutamax Life Technologies12633012
SB431542 R&D Systems1614
SCFPeproTech300-07
SMAInvitrogen50-9760-80
STEMdiff APEL 2 MediumSTEMCELL Technologies5275
TrypLE ExpressGibco12605-028
VEGF165Preprotech100-20
VimentinCell Signaling5741S
Y-27632 (Rock Inhibitor) R&D Systems1254/1
ZO-1Invitrogen339100

Références

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