Co-coltura di cellule epiteliali, mesenchimali, endoteliali e immunitarie derivate da iPSC per modellare l'integrità della barriera aerea nella salute e nella malattia polmonare

Riepilogo

Questo articolo descrive la generazione di un modello complesso di barriera multicellulare delle vie aeree composto da epitelio polmonare derivato da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), mesenchima, cellule endoteliali e macrofagi in una coltura di interfaccia aria-liquido.

Abstract

Il tessuto polmonare umano è composto da una rete interconnessa di epitelio, mesenchima, endotelio e cellule immunitarie dalle vie aeree superiori del rinofaringe al sacco alveolare più piccolo. Le interazioni tra queste cellule sono cruciali nello sviluppo polmonare e nella malattia, fungendo da barriera contro le sostanze chimiche nocive e gli agenti patogeni. Gli attuali modelli di co-coltura in vitro utilizzano linee cellulari immortalizzate con diversi background biologici, che potrebbero non rappresentare accuratamente l'ambiente cellulare o le interazioni del polmone. Abbiamo differenziato le iPSC umane in organoidi polmonari 3D (contenenti sia epitelio che mesenchima), cellule endoteliali e macrofagi. Questi sono stati co-coltivati in un formato di interfaccia aria-liquido (ALI) per formare una barriera apicale epiteliale/mesenchimale investita di macrofagi e una barriera endoteliale basolaterale (iAirway). iAirways derivata da iPSC ha mostrato una riduzione dell'integrità della barriera in risposta all'infezione da virus respiratori e tossine di sigaretta. Questo sistema di co-coltura polmonare multi-lineage fornisce una piattaforma per lo studio delle interazioni cellulari, delle vie di segnalazione e dei meccanismi molecolari alla base dello sviluppo polmonare, dell'omeostasi e della progressione della malattia. iAirways imita da vicino la fisiologia umana e le interazioni cellulari, può essere generato da iPSC derivate dal paziente e può essere personalizzato per includere diversi tipi di cellule delle vie aeree. Nel complesso, i modelli di iAirway derivati da iPSC offrono uno strumento versatile e potente per studiare l'integrità della barriera per comprendere meglio i fattori genetici della malattia, la risposta ai patogeni, la regolazione immunitaria e la scoperta o il riposizionamento di farmaci in vitro, con il potenziale per far progredire la nostra comprensione e il trattamento delle malattie delle vie aeree.

Introduzione

La barriera sangue-aria nelle grandi vie aeree comprende la trachea, i bronchi e i bronchioli. Svolge un ruolo cruciale nel mantenimento della salute respiratoria ed è costituito dall'epitelio delle vie aeree, dalla membrana basale, dai vasi sanguigni e dalle cellule endoteliali e dalle cellule immunitarie. Le cellule epiteliali primarie delle vie aeree comprendono le cellule basali, le cellule club, le cellule ciliate e le cellule caliciformi. Le cellule basali, che agiscono come cellule staminali dell'epitelio delle vie aeree, sono progenitori multipotenti con elevate capacità proliferative e di autorinnovamento, dando origine a cellule epiteliali mature delle vie aeree¹. Le cellule club sono cellule secretorie non ciliate che contribuiscono al mantenimento del rivestimento delle vie aeree secernendo proteine protettive e tensioattivi². Le cellule caliciformi, situate nel lume e nelle ghiandole sottomucose, secernono mucine per intrappolare i detriti e salvaguardare le vie aeree³. Le cellule ciliate sono parte integrante del meccanismo della scala mobile mucociliare, prevenendo l'accumulo di microrganismi dannosi⁴. La membrana basale è costituita da una matrice extracellulare, che fornisce supporto strutturale⁵. La trachea e il resto delle vie aeree sono circondati da una ricca rete di vasi sanguigni, che sono rivestiti da cellule endoteliali che svolgono un ruolo vitale nel sostenere la funzione tracheale fornendo nutrienti e ossigeno, rimuovendo le scorie, regolando l'infiammazione e contribuendo alla riparazione dei tessuti e all'angiogenesi⁶. Infine, i macrofagi delle vie aeree sono cellule immunitarie tessuto-specifiche, essenziali per proteggere il sistema respiratorio dalle infezioni, eliminare le particelle inalate e mantenere una risposta immunitaria equilibrata⁷.

Le azioni coordinate delle cellule epiteliali, mesenchimali, endoteliali e delle cellule macrofagiche sono fondamentali per un'efficace risposta immunitaria ai patogeni nelle vie aeree⁸. Le cellule epiteliali costituiscono la prima linea di difesa contro le infezioni virali agendo come una barriera fisica, con giunzioni strette che limitano il passaggio di sostanze nocive. L'azione coordinata delle cellule ciliate e delle cellule caliciformi aiuta a intrappolare e rimuovere le particelle inalate, gli agenti patogeni e i detriti⁴. Inoltre, le cellule epiteliali delle vie aeree producono citochine e chemochine per reclutare le cellule immunitarie⁹. Le cellule endoteliali mantengono l'integrità vascolare, prevenendo la diffusione di particelle virali attraverso il flusso sanguigno, sovraregolano le molecole di adesione (VCAM-1) per facilitare l'adesione delle cellule immunitarie e producono citochine pro-infiammatorie per reclutare le cellule immunitarie dal flusso sanguigno al sito dell'infezione¹⁰. I macrofagi delle vie aeree inghiottono e digeriscono particelle virali, cellule infette e detriti, presentano antigeni virali alle cellule T e producono citochine per attivare e reclutare altre cellule immunitarie, insieme agli interferoni di tipo I per inibire la replicazione virale¹¹. Le azioni coordinate delle cellule epiteliali, mesenchimali, endoteliali e macrofagiche creano un sistema di difesa robusto e dinamico che protegge le vie aeree dalle infezioni virali e mantiene la salute respiratoria.

Comprendere le interazioni dinamiche tra i vari tipi di cellule del polmone umano è fondamentale per comprendere la risposta del polmone alle infezioni virali, alle malattie infiammatorie e alla somministrazione di farmaci. Le co-colture in vitro consentono lo studio della segnalazione cellula-cellula tra l'epitelio, le cellule endoteliali e le cellule immunitarie innate¹². Abbiamo sviluppato il primo autentico modello polmonare di tipo multicellulare derivato da hiPSC¹³ specifiche per il paziente. Questo incorpora popolazioni di cellule sia epiteliali che mesenchimali, formate con un orientamento 3D. Successivamente, le cellule progenitrici polmonari possono essere differenziate in un "organoide delle vie aeree"¹⁴, coltivate su inserti di coltura cellulare sterili ed esposte a un'interfaccia aria-liquido (ALI), replicando le condizioni delle vie aeree umane 15,16,17. Le cellule endoteliali derivate da iPSC vengono coltivate sul lato basolaterale della membrana, imitando il loro orientamento nelle vie aeree umane, situate al di sotto dello strato epiteliale/mesenchimale nella membrana basale. Infine, i macrofagi derivati da iPSC vengono aggiunti al lato apicale della membrana, interagendo con le cellule epiteliali e attendendo segnali di attivazione (Figura 1A). Questo modello riproduce accuratamente la biologia e la funzione delle vie aeree. Ipotizziamo che le colture iAirway di tipo multicellulare autentiche derivate da hiPSC, specifiche per il paziente e autentiche siano le più adatte per chiarire la risposta acuta intrinseca della barriera delle vie aeree e dei patogeni, comprese le infezioni virali. Ad esempio, questo modello può essere utilizzato per (1) studiare l'ingresso e la replicazione virale, (2) studiare la risposta immunitaria iniziale da parte delle cellule immunitarie epiteliali e tessuto-specifiche, (3) esaminare l'integrità e la funzione della barriera, (4) testare l'efficacia degli agenti terapeutici e (5) studiare i meccanismi cellulari e molecolari della patogenesi in un modello specifico per il paziente.

Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per la preparazione di co-colture polmonari multicellulari per studiare le risposte cellulari alle infezioni virali.

Protocollo

Questo protocollo di studio è stato approvato dall'Institutional Review Board del Programma di protezione della ricerca umana dell'UCSD (181180). Questo protocollo utilizza piccole molecole e fattori di crescita per dirigere la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti in cellule delle vie aeree, cellule endoteliali e macrofagi. Queste cellule vengono quindi co-coltivate su inserti di coltura cellulare e polarizzate in un'interfaccia aria-liquido. I dettagli dei reagenti, dei materiali di consumo e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei materiali. Le composizioni dei media e dei buffer sono fornite nel File supplementare 1.

1. Generazione di organoidi delle vie aeree derivati da iPSC (Giorno 1 - 30)

NOTA: Questo protocollo delinea i passaggi necessari per generare organoidi delle vie aeree derivati da iPSC (Figura 1B), seguendo la metodologia descritta in Leibel et ^al.13. Il processo include l'induzione dell'endoderma definitivo (giorni 1-3), la generazione dell'endoderma anteriore dell'intestino anteriore (giorni 4-6) e la differenziazione in progenitori polmonari (giorni 7-16). La metodologia dettagliata è riportata nella precedente pubblicazione¹³. I passaggi seguenti descrivono in dettaglio la generazione di organoidi delle vie aeree dai progenitori polmonari.

1. Estrazione e dissociazione di sferoidi progenitori polmonari dal polimero della ECM (Giorno 17)
   1. Scongelare il polimero della matrice extracellulare (ECM) (8-9 mg/mL) su ghiaccio.
   2. Aspirare i terreni esausti, utilizzando un aspiratore a vuoto, da organoidi polmonari incorporati nella MEC.
      NOTA: Per le successive fasi di aspirazione, utilizzare un aspiratore a vuoto, se non diversamente specificato.
   3. Aggiungere 1 mL di 2 U/mL di dispasi integrata con 10 μM di inibitore ROCK1 (ROCKi) alle cellule e utilizzare una pipetta P1000 per risospendere manualmente i progenitori polmonari nella MEC. Incubare per 30 minuti a 37 °C, risospendendo la miscela ogni 15 minuti per migliorare l'efficacia della dissociazione della dispasi attraverso il processo meccanico.
   4. 15 minuti prima dell'uso, mettere 45 ml di PBS a temperatura ambiente in un congelatore a -20 °C per raffreddare. Assicurarsi che il PBS sia più freddo di 4 °C per una depolimerizzazione ECM ottimale nelle fasi successive.
   5. Dopo 30 minuti di incubazione della dispasi, trasferire l'organoide e la soluzione di dispasi in una provetta conica da 15 mL.
   6. Aggiungere PBS refrigerato (2 mL per 1 mL di proteasi) per lavare e raccogliere l'organoide residuo e il materiale ECM dalla piastra. Risospendere gli organoidi utilizzando una pipetta P1000 e centrifugare a 400 x g per 5 minuti.
      NOTA: Tutte le fasi di centrifugazione vengono eseguite a temperatura ambiente, se non diversamente specificato in questo protocollo.
   7. Dopo la centrifugazione, dovrebbe essere visibile un pellet ECM torbido con organoidi. Aspirare con cura il surnatante tramite pipetta, evitando il pellet ECM.
   8. Eseguire un secondo lavaggio PBS con PBS freddo, risospendere utilizzando una pipetta P1000 e centrifugare a 400 x g per 5 minuti. Aspirare il surnatante tramite pipetta, lasciando ~100 μL di soluzione residua.
   9. Aggiungere 2 mL di proteasi tripsina-simile agli organoidi nella provetta conica da 15 mL. Risospendere utilizzando una pipetta P1000. Incubare per 10-12 minuti a 37 °C, capovolgendo o muovendo la provetta per risospendere la miscela a metà dell'incubazione.
      NOTA: Eseguire 10-12 minuti di dissociazione della proteasi simile alla tripsina per far passare gli organoidi come aggregati.
   10. Dopo 12 minuti, interrompere la reazione della proteasi tripsina-simile aggiungendo 2 mL di FBS al 2% nel terreno di base (Stop Media, vedere il File supplementare 1). Risospendere la soluzione con una pipetta P1000 e centrifugare a 400 x g per 5 minuti.
   11. Aspirare il surnatante e risospendere gli organoidi in Stop Media integrati con 10 μM di ROCKi. Prelevare un campione da 10 μl per la conta cellulare utilizzando un emocitometro e il blu di tripano. Mantenere gli organoidi sul ghiaccio durante il conteggio.
   12. Calcolare il volume necessario per ottenere 100.000 celle per pozzetto. La cella aliquote viene aggregata in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugata per 5 minuti a 400 x g. Rimuovere il surnatante in eccesso, lasciando 10 μL di terreno residuo.
   13. Risospendere il pellet cellulare in 200 μL di polimero ECM freddo (evitare bolle e lavorare rapidamente per prevenire la polimerizzazione prematura). Aggiungere 200 μl di ECM e miscela di cellule sul fondo di ciascun pozzetto in una piastra a 12 pozzetti. Lasciare che l'ECM polimerizzi parzialmente a temperatura ambiente nella cabina di biosicurezza per 5 minuti.
   14. Trasferire la piastra in un incubatore a 37 °C per 30-60 minuti per completare la polimerizzazione ECM. Quindi, aggiungere 1,5 ml di terreno di induzione degli organoidi delle vie aeree (File supplementare 1).
   15. Cambia il mezzo a giorni alterni per 14 giorni fino al giorno 30. Se il terreno diventa giallo entro 24 ore, aumentare il volume a 2 ml.

2. Generazione di cellule endoteliali derivate da iPSC (giorno 1 - 14)

NOTA: La seguente procedura descrive in dettaglio la generazione di cellule endoteliali da iPSC (Figura 1C), adattata da Patsch et ^al.18. Questo metodo include la preparazione delle piastre, la differenziazione delle iPSC, l'induzione, lo smistamento e l'espansione delle cellule endoteliali. La Tabella 1 elenca gli anticorpi utilizzati in questo studio.

1. Placcatura di iPSC per la differenziazione endoteliale (Giorno 0)
   1. Inizia la differenziazione delle cellule endoteliali quando le hiPSC raggiungono il 70%-80% di confluenza. Aggiungere 10 μM di ROCKi Y-27632 a ciascun pozzetto un'ora prima della dissociazione.
   2. Aspirare il terreno, lavare i pozzetti con 1 mL di PBS, quindi dissociare le iPSC aggiungendo 1 mL di soluzione di distacco cellulare per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Incubare per 20 minuti a 37 °C.
   3. Neutralizzare la soluzione di distacco cellulare aggiungendo 2 mL di Stop Media ai pozzetti. Pipetta per ottenere una sospensione a singola cellula. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL e centrifugare per 5 minuti a 300 x g.
   4. Aspirare il surnatante, risospendere le iPSC in terreni di coltura iPSC integrati con 10 μM di ROCKi ed eseguire una conta cellulare. Piastra 100.000 hiPSC per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti rivestita con ECM in 1 mL di terreno di coltura iPSC con 10 μM di ROCKi. Incubare per una notte a 37 °C.
      NOTA: La densità di semina per la differenziazione endoteliale delle iPSC potrebbe richiedere un'ottimizzazione per linea cellulare. Valutare l'efficienza della differenziazione utilizzando la citometria a flusso per CD31 il giorno 6.
2. Induzione laterale del mesoderma (giorni 1-3)
   1. Aspirare i terreni di coltura iPSC dalle iPSC piastrate e aggiungere 3 mL di terreno di base N2B27 integrati con 6 μM di CHIR e 25 ng/mL di BMP4 per pozzetto (File supplementare 1). Riscaldare il supporto prima di aggiungerlo alle celle. Non cambiare il supporto per 3 giorni.
3. Induzione delle cellule endoteliali (giorni 4-5)
   1. Il giorno 4, aspirare il terreno N2B27 e aggiungere 2 mL di terreno di differenziazione endoteliale (EDM) integrati con 200 ng/mL di VEGF165 e 2 μM di forskolina per pozzetto. Cambia i media il giorno 5.
4. Selezione e replating delle cellule endoteliali (Giorno 6)
   1. Il giorno 5 o 6, preparare un pallone T75 rivestito di fibronectina per l'arricchimento di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) ricostituendo 1 mg di fibronectina in acqua sterile per ottenere una soluzione di 100 μg/mL di fibronectina. Rivestire il matraccio T75 con 6 mL di soluzione di fibronectina e incubare a temperatura ambiente per un'ora. Aspirare la soluzione di fibronectina e lavare con acqua sterile. Lasciare asciugare il pallone T75 a temperatura ambiente. I palloni extra possono essere conservati a 4 °C.
   2. Preparare i terreni di mantenimento endoteliali (EMM)¹⁸.
   3. Il giorno 6, arricchire le cellule endoteliali derivate da iPSC tramite FACS utilizzando l'anticorpo CD31¹⁸.
   4. Aggiungere 10 μM di ROCKi Y-27632 a ciascun pozzetto un'ora prima della dissociazione a 37°C. Aspirare il terreno e lavare con PBS. Aggiungere 1 mL di soluzione di distacco cellulare preriscaldata per pozzetto di una piastra a 12 pozzetti e incubare per 8-10 minuti a 37°C.
   5. Pipettare delicatamente per garantire il distacco di una singola cellula. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL e aggiungere un volume uguale di Stop Media. Centrifugare per 5 min a 300 x g.
   6. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule endoteliali in 1 mL di Stop Media integrato con 10 μM di ROCKi.  Far passare le celle attraverso il filtro da 70 μm aggiungendo prima 1 ml di liquido di arresto per bagnare il filtro, quindi pipettare le cellule attraverso il filtro. Prelevare un campione da 10 μl per la conta cellulare utilizzando un emocitometro e il blu di tripano. Mantenere le cellule sul ghiaccio durante il conteggio.
   7. Eseguire un conteggio delle celle. Preparare un'aliquota di 200.000 cellule come controllo negativo non colorato. Trasferire le cellule rimanenti in una provetta Eppendorf da 1,5 mL e aggiungere 10 μL di CD31-APC per ogni 1 milione di cellule in 100 μL di tampone FACS. Incubare per 30 minuti su un rotatore a 4 °C.
   8. Una volta completata l'incubazione, centrifugare la provetta Eppendorf con le cellule per 5 minuti a 300 x g, lavare le cellule aggiungendo 1 ml di PBS. Ripetere due volte la fase di lavaggio e centrifugazione. Rimuovere manualmente il surnatante tra un lavaggio e l'altro.
   9. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone FACS e 5 ug/mL di soluzione DAPI per la colorazione di vitalità, 5 minuti prima della cernita. Ordina secondo le linee guida istituzionali.
   10. Raccogliere le cellule selezionate FACS in una provetta conica da 15 mL con 2 mL di EMM. Centrifugare la provetta conica da 15 ml con le cellule per 5 minuti a 300 x g. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule endoteliali in 10 mL di EMM integrati con 10 μM di ROCKi Y-27632 e Penicillina Streptomicina (1%).
   11. Trasferire le cellule endoteliali derivate da iPSC arricchite con FACS risospese nel pallone rivestito di fibronectina. Distribuire uniformemente le cellule e metterle in un'incubatrice a 37 °C per una notte.
       NOTA: Utilizzare un minimo di 500.000 celle e un massimo di 2.000.000 di celle per matraccio T75.
5. Espansione e crioconservazione di cellule endoteliali selezionate (Giorno 7+)
   1. Cambia il supporto EMM ogni 2-3 giorni dopo l'arricchimento FACS. Una volta che il pallone T75 diventa confluente (circa 7 giorni dopo la FACS, a seconda della densità di semina), le cellule endoteliali derivate da iPSC possono essere utilizzate per la co-coltura o crioconservate per applicazioni future.
   2. Preparare una soluzione di congelamento endoteliale 2x prima della dissociazione cellulare (80% Endo-CM2, 20% DMSO, 20 μM di ROCKi).
   3. Etichettare le provette crioviali in una penna a prova di etanolo con le rispettive informazioni. ID della linea, numero di passaggio, terreno di coltura, "scongelamento in un pozzo 6", data di congelamento.
   4. Quando le cellule endoteliali derivate da iPSC selezionate sono confluenti, avviare la dissociazione.
   5. Lavare il pallone T75 con 5 ml di PBS -/-.
   6. Dissociare le cellule endoteliali derivate da iPSC con 5 ml di proteasi tripsina-simile per T75. Incubare le cellule a 37 °C PER 10 minuti, controllando periodicamente il T75 per verificare che le cellule si siano sollevate.
   7. Neutralizzare la reazione aggiungendo 5 ml di Stop Media. Trasferire 10 mL di cellule in soluzione in una provetta da 15 mL. Centrifugare a 300 x g per 5 min.
   8. Aspirare il surnatante, risospendere le cellule endoteliali in terreni E-CBM e prelevare un campione da 10 μL per il conteggio tramite l'ematocitometro.
   9. Dopo la conta cellulare, aliquotare 1 milione di cellule per 0,5 mL di terreno EGM2.
      NOTA: Il passaggio seguente è sensibile al fattore tempo. Preparare i crioviali e i recipienti di congelamento da utilizzare immediatamente.
   10. Aliquotare un volume uguale di 2x soluzione di congelamento alle cellule endoteliali. La concentrazione finale è del 90% di Endo-CM2, del 10% di DMO e del 10 μM di ROCKi (1 mL/1 milione di cellule).
   11. Trasferire immediatamente i flaconcini tappati in una camera di congelamento e metterli a -80 °C per una notte, quindi in azoto liquido (-180 °C) il giorno successivo per la conservazione a lungo termine.

3. Generazione di macrofagi derivati da iPSC (Giorno 1 - 26)

NOTA: Questa procedura delinea i passaggi per generare macrofagi da iPSC (Figura 1D), adattati da van Wilgenburg et ^al.19 e Pouyanfard et ^al.20. Copre l'adattamento a singola cellula delle iPSC, la differenziazione del corpo embrioide, la formazione dei progenitori dei macrofagi e la maturazione dei macrofagi.

1. Adattamento a singola cellula di iPSC
   1. Quando le iPSC raggiungono una confluenza del ~70%-90% senza segni visibili di differenziazione, iniziare il passaggio di una singola cellula con la proteasi simile alla tripsina.
   2. Aspirare il terreno esaurito e risciacquare con PBS. Rimuovere la PBS e aggiungere la proteasi tripsina-simile (1 mL/pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, 500 μL/pozzetto di una piastra a 12 pozzetti). Incubare a 37 °C per 2-5 minuti fino a quando le colonie di iPSC non si dissociano dalla piastra.
   3. Neutralizzare la proteasi tripsina-simile con un volume uguale di terreno di arresto (1 mL/pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, 500 μL/pozzetto di una piastra a 12 pozzetti). Centrifugare le celle a 200 x g per 5 min.
   4. Aspirare il surnatante e risospendere delicatamente le cellule in terreni di coltura iPSC con 10 μM di ROCKi. Passaggio su nuove piastre rivestite ECM. Ripetere per 2-3 passaggi prima di crioconservare o utilizzare le iPSC adattate a cellula singola.
      NOTA: Regolare il rapporto di passaggio da 1:2 a 1:10 in base alla salute e all'adattamento delle cellule. Inoltre, le iPSC che hanno subito almeno tre passaggi a singola cellula e sono a basso passaggio producono differenziazioni ottimali dei macrofagi.
2. Formazione del corpo embrioide (Giorno 0-6)
   1. Quando le iPSC adattate a singola cellula raggiungono una confluenza del ~75%, le iPSC passano con la proteasi simile alla tripsina secondo i passaggi 3.1-3.4.
   2. Risospendere le cellule nel terreno di arresto e passarle attraverso un colino cellulare da 70 μm in una nuova provetta conica da 50 ml per rimuovere i grumi. Risospendere le cellule e prelevare un campione da 10 μL per la conta cellulare tramite l'ematocitometro.
   3. Per la generazione di corpi embrioidi (EB), vengono piastrate 8.000-50.000 cellule per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con attacco ultra-basso (ULA). Calcolare il numero totale di cellule necessarie per seminare 60 pozzetti di una piastra ULA a 96 pozzetti.
      NOTA: La densità di semina delle iPSC può richiedere un'ottimizzazione per linea cellulare.
   4. Centrifugare le iPSC in 15 mL coniche a 200 x g per 5 min. Aspirare il surnatante.
   5. Per 480.000 iPSC (8.000 cellule/pozzetto in 60 pozzetti), risospendere in 6 mL (100 ul/pozzetto in 60 pozzetti) di terreno di induzione EB.
   6. Aggiungere 150 μl di PBS ai 36 pozzetti esterni di una piastra ULA a fondo tondo a 96 pozzetti.
   7. Risospendere e trasferire gli iPSC nei media EB a un media trough. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 μL/pozzetto di sospensione cellulare nei 60 pozzetti centrali della piastra ULA a 96 pozzetti. Risospendere le iPSC in terreni EB in modo intermittente per garantire una distribuzione uniforme delle cellule.
   8. Centrifugare la piastra a 96 pozzetti a 300 x g per 5 minuti a 4 °C (se disponibile). Trasferire le piastre in un'incubatrice a 37 °C.
   9. Dopo 48-72 ore, sostituire 50 μL del terreno (cambio del mezzo di coltura). Verificare la formazione di cisti dopo 6 giorni.
      NOTA: Alcune linee iPSC formano EB prima o più facilmente di altre. Monitorare la formazione di EB e assicurarsi che gli EB vengano trasferiti nel momento appropriato (dovrebbero sviluppare cisti).
3. Rivestimento di gelatina e trasferimento di EB per la formazione dei progenitori dei macrofagi (Giorno 6-19)
   1. Preparare due piastre a 6 pozzetti rivestite di gelatina allo 0,1%. Aggiungere 1 mL di gelatina allo 0,1% per pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti. Aspirare la soluzione di gelatina e lasciare asciugare le piastre nella cappa per 30-60 minuti.
   2. Trasferire gli EB dalla piastra a 96 pozzetti alle piastre a 6 pozzetti rivestite di gelatina utilizzando una pipetta sierologica da 2 mL. Distribuire circa 8-10 EB per pozzetto di una piastra gelatinizzata a 6 pozzetti.
   3. Rimuovere con cautela i residui di materiale EB utilizzati dal trasferimento. Aggiungere 2 mL di terreno di coltura macrofagico 1 (Mac-CM1) per pozzetto. Incubare gli EB indisturbati a 37 °C con il 5% di CO₂ per 5-7 giorni.
      NOTA: Idealmente, una piastra a 96 pozzetti di corpi embrioidi può essere divisa in due piastre a 6 pozzetti. Se gli EB sono scarsamente sviluppati, il numero di EB trasferiti per piastra a 6 pozzetti può essere regolato per ottimizzare la fase di differenziazione iPSC-corpo embrioide.
4. Generazione di progenitori macrofagici
   1. Sostituire 2/3 del supporto due volte a settimana, aumentando il volume a 3 ml se il colore del supporto cambia.
   2. Controlla le colture tra i giorni 8-19 per determinare se sono pronte per la raccolta dei progenitori dei macrofagi. Se gli EB si staccano, trasferirli su una piastra appena rivestita con Mac-CM1 e incubare indisturbati per 7 giorni.
      NOTA: Il mantenimento del complesso progenitore dei macrofagi è vitale per lo sviluppo e la generazione continua dei progenitori dei macrofagi. I complessi ottimizzati che formano progenitori macrofagici genereranno continuamente progenitori mieloidi per 2-6+ mesi.
5. Raccolta dei progenitori mieloidi (Giorno 19-26+)
   1. Quando ci sono cellule progenitrici dei macrofagi in sospensione, raccogliere il terreno con le cellule e trasferirlo in una provetta conica da 50 mL. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti e rimuovere con cura il surnatante.
   2. Risospendere i progenitori dei macrofagi in Mac-CM2 e trasferirli in una piastra/matraccio di coltura sterile non trattata. Incubare a 37 °C con CO₂ al 5% per 3-4 giorni.
      NOTA: A seconda del numero di cellule raccolte, trasferirle in una piastra di Petri da 10 cm (3-4 pozzetti di una piastra a 6 pozzetti), in un pallone T25 (1-2 pozzetti di una piastra a 6 pozzetti) o in un pallone T75 (piastra piena a 6 pozzetti) con il volume appropriato di terreno. Utilizzare 5-6 mL di terreno per un matraccio T25, 10-12 mL di terreno in una piastra di Petri e 12-15 mL di terreno per un pallone T75. Per i raccolti successivi, i progenitori mieloidi e le cellule macrofagiche possono essere raggruppati da raccolti precedenti se provengono dalla stessa linea/complessi di formazione mieloide. Assicurarsi che il pallone sia sufficiente per mantenere e alimentare il numero di celle nel pallone. I macrofagi non proliferano; Sono generati da progenitori macrofagi. I macrofagi possono essere raggruppati e mantenuti per 2-6 settimane senza perdere i marcatori di espressione.
6. Raccolta di macrofagi
   NOTA: Dopo 14 giorni di differenziazione dei macrofagi in terreni Mac-CM2, le colture di macrofagi sono pronte per la co-coltura o l'analisi di citometria a flusso.
   1. Raccogliere i terreni esauriti e trasferirli in una provetta conica da 50 mL. Sciacquare il pallone/piastra con PBS per rimuovere i residui di terreno e le cellule.
   2. Aggiungere il terreno di base al pallone (3 mL per il T25 e 5 mL per il T75) e utilizzare un raschietto per cellule sterile per staccare le cellule dal fondo del pallone/piastra. Trasferire le cellule in un tubo conico e ripetere la raschiatura se necessario.
   3. Centrifugare a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente. Rimuovere con cautela il surnatante e risospendere le cellule in un terreno o tampone appropriato per un ulteriore utilizzo.

4. Co-coltura di cellule delle vie aeree, cellule endoteliali e macrofagi

NOTA: Questa procedura descrive i passaggi per la co-coltura di cellule delle vie aeree, cellule endoteliali e macrofagi (Figura 1A) utilizzando inserti di coltura cellulare, adattati da Costa et ^al.12.

1. Rivestimento ECM di inserti per colture cellulari per co-coltura (Giorno 0 di co-coltura)
   1. Rivestire gli inserti per colture cellulari in poliestere poroso (PET) da 3,0 μm con una soluzione ECM da 4 mg/mL. Rivestire brevemente il lato apicale degli inserti di coltura cellulare all'interno della piastra con 4 mg/mL di soluzione ECM. Pipettare la soluzione ECM residua. Porre la piastra nell'incubatore per 1 ora a 37 °C.
   2. Procurarsi una capsula di Petri grande (100 mm x 20 mm o 150 mm x 20 mm). Con una pinzetta pulita, trasferire sterilemente gli inserti di coltura cellulare dalla piastra a 12 pozzetti nella grande piastra di Petri. Invertire gli inserti in modo che il lato basolaterale sia in posizione verticale.
   3. Rivestire il lato basolaterale con una soluzione ECM da 4 mg/mL. Pipettare la soluzione ECM residua. Posizionare la piastra di Petri con inserti di coltura cellulare rivestiti di ECM in un'incubatrice a 37 °C per farla asciugare per una notte.
2. Dissociazione e piastratura di cellule endoteliali derivate da iPSC (Giorno 1 di co-coltura)
   1. Lavare il pallone T75 con PBS e aspirare la soluzione. Aggiungere 5 mL di proteasi tripsina-simile al pallone T75 e incubare a 37 °C per 8 minuti. Valutare visivamente che le cellule endoteliali siano state sollevate dal pallone.
      NOTA: Aumentare il tempo di dissociazione della proteasi tiposina se le cellule endoteliali derivate da iPSC non si sono sollevate dal pallone.
   2. Picchiettare il pallone per garantire il distacco delle cellule endoteliali e trasferire le cellule in una conica da 15 mL. Aggiungere 5 ml di Stop Media per arrestare la dissociazione. Centrifugare le celle a 300 x g per 5 min.
   3. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno di coltura endoteliale con 10 μM di ROCKi. Ottenere 10 μL di soluzione risospesa per la conta cellulare e porre le cellule su ghiaccio durante la conta.
   4. Utilizzare 150.000 cellule endoteliali iPSC per inserto di coltura cellulare da 12 mm in 100 μL di terreno di coltura endoteliale. Regolare il rispettivo volume del supporto per raggiungere il numero desiderato di celle per inserto.
   5. Ottenere dall'incubatore una piastra di Petri con inserti per colture cellulari da 3,0 μm rivestiti di ECM (vedere i passaggi 4.1-4.3).
   6. Risospendere le cellule endoteliali iPSC e pipettare 100 μl con 150.000 cellule sull'inserto di coltura cellulare capovolto (lato basolaterale rivolto verso l'alto). Pipettaggio ripetuto per ciascuno degli inserti per colture cellulari preparati
   7. Trasferire con cura le cellule nell'incubatrice e lasciarle indisturbate per 3 ore.
   8. In una piastra da 12 pozzetti, aggiungere 1 mL di terreno di coltura endoteliale in ciascun pozzetto (per il rispettivo numero di inserti di coltura cellulare preparati).
   9. Estrarre la capsula di Petri con le cellule endoteliali dall'incubatrice. Utilizzando una pinzetta pulita, trasferire con cura gli inserti di coltura cellulare nella piastra con i terreni di coltura endoteliali (capovolgendo l'inserto in modo che la parte inferiore sia ora rivolta verso il basso nel terreno).
   10. Verificare visivamente al microscopio che le cellule endoteliali abbiano aderito. Porre la piastra in un'incubatrice a 37 °C per una notte.
3. Dissociazione e placcatura di organoidi delle vie aeree derivati da iPSC (Giorno 2 di co-coltura)
   NOTA: Fare riferimento ai passaggi 1.1.1-1.1.15 per l'isolamento degli organoidi delle vie aeree dal polimero ECM. Modificare la durata della dissociazione della proteasi tripsina-simile (passaggio 1.1.10) a 15-20 minuti per ottenere una sospensione a cellula singola.
   1. Dopo 15-20 minuti, interrompere la reazione della proteasi tripsina-simile aggiungendo 3 ml di Stop Media. Risospendere la soluzione con una pipetta P1000 e centrifugare a 400 x g per 5 minuti.
   2. Aspirare il surnatante e risospendere gli organoidi delle vie aeree in 1 mL di terreno di espansione delle vie aeree con 10 μM di ROCKi. Prelevare un campione da 10 μl per la conta delle cellule dell'ematocitometro e posizionare le cellule sul ghiaccio durante il conteggio.
   3. Semina 300.000 cellule iPSC delle vie aeree in 500 μL di terreno di espansione delle vie aeree per inserto di coltura cellulare da 12 mm. Regolare il rispettivo volume del supporto per raggiungere il numero desiderato di celle per inserto preparato.
   4. Rimuovere la piastra con inserti per colture cellulari con cellule endoteliali (seminate sul lato basolaterale) dall'incubatore a 37 °C.
   5. Risospendere le cellule delle vie aeree iPSC e pipettare 500 μl con 300.000 cellule nella camera apicale di ciascun inserto di coltura cellulare. Porre la piastra in un incubatore a 37 °C per 48 ore con le celle apicali in condizioni liquido-liquido.
4. Co-cultura del trasporto aereo (Giorno 4 della co-cultura)
   1. Rimuovere il terreno dal lato apicale dell'inserto per colture cellulari. Sostituire il terreno basolaterale in terreno di differenziazione delle vie aeree 1:1 e terreno di coltura endoteliale. Rimettere la piastra nell'incubatrice.
5. Dissociazione e placcatura di macrofagi derivati da iPSC (Giorno 5 di co-coltura)
   1. Dissociare i macrofagi derivati da iPSC dal pallone utilizzando un raschietto cellulare (vedere i passaggi 3.22-3.24). Centrifugare a 300 x g per 5 min e aspirare il surnatante.
   2. Risospendere i macrofagi iPSC in 1 mL di Mac-CM2. Prelevare un campione da 10 μl per il conteggio delle cellule e posizionare le cellule sul ghiaccio durante il conteggio. Il numero di macrofagi rispecchierà il numero di cellule delle vie aeree seminate (rapporto 1:1 tra macrofagi e cellule delle vie aeree).
   3. Dopo la conta cellulare, aliquotare 300.000 macrofagi in terreni da 35 μl per pozzetto di inserti di coltura cellulare preparati in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifugare a 200 x g per 5 min.
   4. Dopo la centrifugazione, pipettare il surnatante. Risospendere i macrofagi nel rispettivo Mac-CM2 dai calcoli.
   5. Rimuovere gli inserti con co-colture di cellule endoteliali e delle vie aeree dall'incubatore. Seminare 300.000 macrofagi in 35 μL di Mac-CM2 sul lato apicale dell'inserto di coltura cellulare. Mettere la piastra in un'incubatrice a 37 °C per 48 ore.
      NOTA: Per confermare l'aderenza delle cellule iPSC-immunitarie all'inserto di coltura cellulare, le cellule possono essere marcate con una sonda fluorescente. Confermare l'aderenza al microscopio per il segnale fluorescente 48 ore dopo la placcatura dei macrofagi.
6. Tripla co-cultura (Giorno 7 di co-cultura)
   1. Assicurarsi che la co-coltura sia pronta per applicazioni a valle, come gli studi sulle infezioni, le misurazioni della resistenza elettrica transepiteliale (TEER) e i saggi di integrità della barriera.

Risultati

Esistono diverse fasi in cui la differenziazione degli organoidi delle vie aeree, delle cellule endoteliali, delle cellule immunitarie e delle co-colture derivate da iPSC può essere valutata come completata con successo. Le differenziazioni possono essere eseguite in diverse linee iPSC e questo protocollo è stato testato in almeno cinque linee diverse. Il protocollo deve essere adattato a ogni nuova linea iPSC, in particolare modificando e ottimizzando la densità di semina.

Discussione

Lo sviluppo e l'implementazione di un modello della barriera sangue-aria nelle grandi vie aeree per lo studio delle infezioni virali e di altre tossine richiedono un'attenzione meticolosa ai dettagli per garantire il successo della differenziazione e della funzione dei vari tipi di cellule coinvolte. Questa discussione affronterà i fattori chiave per una differenziazione di successo, le potenziali sfide, le applicazioni alternative e le implicazioni per lo studio delle malattie umane. <...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well plates	Corning	3512
12-well inserts, 0.4 µm, translucent	VWR	10769-208
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Accutase	Innovative Cell Tech	AT104
Activin A	R&D Systems	338-AC
All-trans retinoic acid (RA)	Sigma-Aldrich	R2625
ascorbic acid	Sigma	A4544
B27 without retinoic acid	ThermoFisher	12587010
BMP4	R&D Systems	314-BP/CF
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution	Gibco	15260-037
Br-cAMP	Sigma-Aldrich	B5386
CD 14 (FITC)	BioLegend	982502
CD 31 PECAM-1(APC)	R&D System	FAB3567A
CD 45 (PE)	BD Biosciences	560975
CD 68 (PE)	BioLegend	33808
CHIR99021	Abcam	ab120890
CPM	Fujifilm	014-27501
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Dispase	StemCellTech	7913
DMEM/F12	Gibco	10565042
Dorsomorphin	R&D Systems	3093
E-CAD/CD 324 (APC)	BioLegend	324107
EGF	R&D Systems	236-EG
EGM2 Medium	Lonza	CC-3162
EPCAM/CD 326 (APC)	BioLegend	324212
FBS	Gibco	10082139
FGF10	R&D Systems	345-FG/CF
FGF7	R&D Systems	251-KG/CF
Fibronectin	Fisher	356008
Forskolin	Abcam	ab120058
Glutamax	Life Technologies	35050061
Ham’s F12	Invitrogen	11765-054
HEPES	Gibco	15630-080
IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)	Sigma-Aldrich	I5879
IL-3	Peprotech	200-03
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax	Invitrogen	31980030
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828028
Matrigel	Corning	354230
M-CSF	Peprotech	300-25
Monothioglycerol	Sigma	M6145
mTeSR plus Kit (10/case)	Stem Cell Tech	5825
N2	ThermoFisher	17502048
NEAA	Life Technologies	11140050
PBS	Gibco	10010023
Pen/strep	Lonza	17-602F
ReleSR	Stem Cell Tech	5872
RPMI1640 + Glutamax	Life Technologies	12633012
SB431542	R&D Systems	1614
SCF	PeproTech	300-07
SMA	Invitrogen	50-9760-80
STEMdiff APEL 2 Medium	STEMCELL Technologies	5275
TrypLE Express	Gibco	12605-028
VEGF165	Preprotech	100-20
Vimentin	Cell Signaling	5741S
Y-27632 (Rock Inhibitor)	R&D Systems	1254/1
ZO-1	Invitrogen	339100