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Resumo

Este artigo descreve a geração de um modelo complexo de barreira das vias aéreas multicelular composto por epitélio pulmonar derivado de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC), mesênquima, células endoteliais e macrófagos em uma cultura de interface ar-líquido.

Resumo

O tecido pulmonar humano é composto por uma rede interconectada de epitélio, mesênquima, endotélio e células imunes desde as vias aéreas superiores da nasofaringe até o menor saco alveolar. As interações entre essas células são cruciais no desenvolvimento pulmonar e na doença, atuando como uma barreira contra produtos químicos e patógenos nocivos. Os modelos atuais de co-cultura in vitro utilizam linhagens celulares imortalizadas com diferentes origens biológicas, que podem não representar com precisão o meio celular ou as interações do pulmão. Diferenciamos iPSCs humanas em organoides pulmonares 3D (contendo epitélio e mesênquima), células endoteliais e macrófagos. Estes foram co-cultivados em um formato de interface ar-líquido (ALI) para formar uma barreira apical epitelial/mesenquimal revestida de macrófagos e uma barreira endotelial basolateral (iAirway). O iAirways derivado de iPSC mostrou uma redução na integridade da barreira em resposta à infecção por vírus respiratórios e toxinas do cigarro. Este sistema de co-cultura pulmonar de várias linhagens fornece uma plataforma para estudar interações celulares, vias de sinalização e mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento pulmonar, homeostase e progressão da doença. O iAirways imita de perto a fisiologia humana e as interações celulares, pode ser gerado a partir de iPSCs derivados do paciente e pode ser personalizado para incluir diferentes tipos de células das vias aéreas. No geral, os modelos iAirway derivados de iPSC oferecem uma ferramenta versátil e poderosa para estudar a integridade da barreira para entender melhor os fatores genéticos de doenças, resposta a patógenos, regulação imunológica e descoberta ou reaproveitamento de medicamentos in vitro, com o potencial de avançar nossa compreensão e tratamento de doenças das vias aéreas.

Introdução

A barreira sangue-ar nas grandes vias aéreas inclui a traqueia, brônquios e bronquíolos. Ele desempenha um papel crucial na manutenção da saúde respiratória e é composto pelo epitélio das vias aéreas, membrana basal, vasos sanguíneos e células endoteliais e células imunológicas. As células epiteliais primárias nas vias aéreas abrangem células basais, células club, células ciliadas e células caliciformes. As células basais, atuando como células-tronco do epitélio das vias aéreas, são progenitores multipotentes com alta capacidade proliferativa e de autorrenovação, dando origem a células epiteliais maduras das vias aéreas1. As células Club são células secretoras não ciliadas que contribuem para a manutenção do revestimento das vias aéreas secretando proteínas protetoras e surfactantes2. As células caliciformes, localizadas no lúmen e nas glândulas submucosas, secretam mucinas para reter os detritos e proteger as vias aéreas3. As células ciliadas são parte integrante do mecanismo de escada rolante mucociliar, evitando o acúmulo de microrganismos nocivos4. A membrana basal é constituída por uma matriz extracelular, que fornece suporte estrutural5. A traqueia e o resto das vias aéreas são circundados por uma rica rede de vasos sanguíneos, que são revestidos por células endoteliais que desempenham um papel vital no apoio à função traqueal, fornecendo nutrientes e oxigênio, removendo resíduos, regulando a inflamação e contribuindo para o reparo tecidual e angiogênese6. Finalmente, os macrófagos das vias aéreas são células imunes específicas do tecido, essenciais para proteger o sistema respiratório de infecções, limpar as partículas inaladas e manter uma resposta imune equilibrada7.

As ações coordenadas das células epiteliais, mesenquimais, endoteliais e células de macrófagos são críticas para uma resposta imune eficaz a patógenos nas vias aéreas8. As células epiteliais formam a primeira linha de defesa contra infecções virais, agindo como uma barreira física, com junções apertadas que restringem a passagem de substâncias nocivas. A ação coordenada das células ciliadas e das células caliciformes ajuda a reter e remover partículas inaladas, patógenos e detritos4. Além disso, as células epiteliais das vias aéreas produzem citocinas e quimiocinas para recrutar células imunes9. As células endoteliais mantêm a integridade vascular, impedindo a disseminação de partículas virais pela corrente sanguínea, regulam positivamente as moléculas de adesão (VCAM-1) para facilitar a adesão das células imunes e produzem citocinas pró-inflamatórias para recrutar células imunes da corrente sanguínea para o local da infecção10. Os macrófagos das vias aéreas engolfam e digerem partículas virais, células infectadas e detritos, apresentam antígenos virais às células T e produzem citocinas para ativar e recrutar outras células imunes, juntamente com interferons tipo I para inibir a replicação viral11. As ações coordenadas das células epiteliais, mesenquimais, endoteliais e macrófagos criam um sistema de defesa robusto e dinâmico que protege as vias aéreas de infecções virais e mantém a saúde respiratória.

Compreender as interações dinâmicas entre vários tipos de células no pulmão humano é crucial para compreender a resposta do pulmão a infecções virais, doenças inflamatórias e administração de medicamentos. As co-culturas in vitro permitem o estudo da sinalização célula-célula entre o epitélio, as células endoteliais e as células imunes inatas12. Desenvolvemos o primeiro modelo autêntico de pulmão do tipo multicelular derivado de hiPSCs específicos do paciente13. Isso incorpora populações de células epiteliais e mesenquimais, formadas em uma orientação 3D. Posteriormente, as células progenitoras do pulmão podem ser diferenciadas em um "organoide das vias aéreas"14, cultivadas em inserções de cultura de células estéreis e expostas a uma interface ar-líquido (LPA), replicando as condições das vias aéreashumanas15,16,17. As células endoteliais derivadas de iPSC são cultivadas no lado basolateral da membrana, imitando sua orientação nas vias aéreas humanas, situadas abaixo da camada epitelial/mesenquimal na membrana basal. Finalmente, macrófagos derivados de iPSC são adicionados ao lado apical da membrana, interagindo com as células epiteliais e aguardando sinais de ativação (Figura 1A). Este modelo reproduz com precisão a biologia e a função das vias aéreas. Postulamos que as culturas de vias aéreas multicelulares autênticas do tipo iAirway derivadas de hiPSC, específicas do paciente, são mais adequadas para elucidar a resposta intrínseca e aguda da barreira das vias aéreas e patógenos, incluindo infecções virais. Por exemplo, este modelo pode ser usado para (1) estudar a entrada e replicação viral, (2) investigar a resposta imune inicial por células imunes epiteliais e específicas do tecido, (3) examinar a integridade e função da barreira, (4) testar a eficácia de agentes terapêuticos e (5) estudar mecanismos celulares e moleculares de patogênese em um modelo específico do paciente.

Este artigo descreve um protocolo detalhado para a preparação de co-culturas pulmonares multicelulares para estudar as respostas celulares a infecções virais.

Protocolo

Este protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Programa de Proteção à Pesquisa Humana da UCSD (181180). Este protocolo usa pequenas moléculas e fatores de crescimento para direcionar a diferenciação de células-tronco pluripotentes em células das vias aéreas, células endoteliais e macrófagos. Essas células são então co-cultivadas em inserções de cultura de células e polarizadas em uma interface ar-líquido. Os detalhes dos reagentes, consumíveis e equipamentos usados estão listados na Tabela de Materiais. As composições de mídia e buffer são fornecidas no Arquivo Suplementar 1.

1. Geração de organoides das vias aéreas derivados de iPSC (Dia 1 - 30)

NOTA: Este protocolo descreve as etapas necessárias para gerar organoides de vias aéreas derivados de iPSC (Figura 1B), seguindo a metodologia descrita em Leibel et al.13. O processo inclui indução de endoderma definitiva (dias 1-3), geração de endoderma anterior do intestino anterior (dias 4-6) e diferenciação em progenitores pulmonares (dias 7-16). A metodologia detalhada pode ser encontrada na publicação anterior13. As etapas a seguir detalham a geração de organoides das vias aéreas a partir de progenitores pulmonares.

  1. Extração e dissociação de esferoides progenitores pulmonares do polímero ECM (Dia 17)
    1. Descongele o polímero de matriz extracelular (MEC) (8-9 mg/mL) em gelo.
    2. Aspirar meios gastos, usando aspirador a vácuo, de organoides pulmonares embutidos em ECM.
      NOTA: Para as etapas de aspiração subsequentes, use um aspirador a vácuo, salvo indicação em contrário.
    3. Adicione 1 mL de 2 U/mL de dispase suplementada com 10 μM de inibidor de ROCK1 (ROCKi) às células e use uma pipeta P1000 para ressuspender manualmente os progenitores pulmonares na MEC. Incube por 30 min a 37 ° C, ressuspendendo a mistura a cada 15 min para aumentar a eficácia da dissociação da dispase por meio de processamento mecânico.
    4. 15 minutos antes do uso, coloque 45 mL de PBS em temperatura ambiente em um freezer a -20 ° C para esfriar. Certifique-se de que o PBS esteja mais frio que 4 °C para uma despolimerização ideal do ECM nas etapas subsequentes.
    5. Após 30 minutos de incubação de dispase, transfira o organoide e dispase a solução para um tubo cônico de 15 mL.
    6. Adicione PBS resfriado (2 mL por 1 mL de protease) para lavar e coletar organoide residual e material ECM da placa. Ressuspenda os organoides usando uma pipeta P1000 e centrifugue a 400 x g por 5 min.
      NOTA: Todas as etapas de centrifugação são realizadas à temperatura ambiente, a menos que especificado de outra forma neste protocolo.
    7. Após a centrifugação, um pellet de ECM turvo com organoides deve ser visível. Aspire cuidadosamente o sobrenadante via pipeta, evitando o pellet ECM.
    8. Realize uma segunda lavagem de PBS com PBS resfriado, ressuspenda usando uma pipeta P1000 e centrifugue a 400 x g por 5 min. Aspire o sobrenadante por meio de pipeta, deixando ~ 100 μL de solução residual.
    9. Adicione 2 mL de protease semelhante à tripsina aos organoides no tubo cônico de 15 mL. Ressuspenda usando uma pipeta P1000. Incubar durante 10-12 min a 37 °C, invertendo ou sacudindo o tubo para ressuspender a mistura a meio da incubação.
      NOTA: Execute 10-12 min de dissociação de protease semelhante à tripsina para passar organoides como agregados.
    10. Após 12 minutos, interrompa a reação de protease semelhante à tripsina adicionando 2 mL de FBS a 2% no meio base (Stop Media, consulte o Arquivo Suplementar 1). Ressuspenda a solução com uma pipeta P1000 e centrifugue a 400 x g por 5 min.
    11. Aspirar o sobrenadante e ressuspender organoides em Stop Media suplementado com 10 μM de ROCKi. Colher uma amostra de 10 μL para contagem de células utilizando um hemocitómetro e azul de tripano. Mantenha os organoides no gelo durante a contagem.
    12. Calcule o volume necessário para obter 100.000 células por poço. Alíquota agrega células em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifuga por 5 min a 400 x g. Remova o excesso de sobrenadante, deixando 10 μL de meio residual.
    13. Ressuspenda o pellet celular em 200 μL de polímero ECM frio (evite bolhas e trabalhe rapidamente para evitar a polimerização prematura). Adicione 200 μL da mistura de ECM e células ao fundo de cada poço em uma placa de 12 poços. Deixe o ECM polimerizar parcialmente à temperatura ambiente no gabinete de biossegurança por 5 min.
    14. Transfira a placa para uma incubadora a 37 °C por 30-60 min para completar a polimerização do ECM. Em seguida, adicione 1,5 mL de meio de indução organoide das vias aéreas (Arquivo Suplementar 1).
    15. Troque o meio a cada dois dias por 14 dias até o dia 30. Se o meio ficar amarelo em 24 h, aumente o volume para 2 mL.

2. Geração de células endoteliais derivadas de iPSC (Dia 1 - 14)

NOTA: O procedimento a seguir detalha a geração de células endoteliais a partir de iPSCs (Figura 1C), adaptado de Patsch et al.18. Este método inclui a preparação de placas, diferenciação de iPSCs, indução de células endoteliais, classificação e expansão. A Tabela 1 lista os anticorpos utilizados neste estudo.

  1. Plaqueamento de iPSCs para diferenciação endotelial (Dia 0)
    1. Inicie a diferenciação das células endoteliais quando as hiPSCs atingirem 70% -80% de confluência. Adicione 10 μM de ROCKi Y-27632 a cada poço uma hora antes da dissociação.
    2. Aspire o meio, lave os poços com 1 mL de PBS e, em seguida, dissocie as iPSCs adicionando 1 mL de solução de descolamento celular por poço de uma placa de 12 poços. Incubar durante 20 min a 37 °C.
    3. Neutralize a solução de desprendimento celular adicionando 2 mL de Stop Media aos poços. Pipeta para obter uma suspensão unicelular. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL e centrifugue por 5 min a 300 x g.
    4. Aspire o sobrenadante, ressuspenda as iPSCs em meios de cultura iPSC suplementados com 10 μM de ROCKi e faça uma contagem de células. Placa de 100.000 hiPSCs por poço de uma placa de 12 poços revestida com ECM em 1 mL de meio de cultura iPSC com 10 μM de ROCKi. Incubar durante a noite a 37 °C.
      NOTA: A densidade de semeadura para diferenciação endotelial iPSC pode precisar de otimização por linha celular. Avalie a eficiência da diferenciação usando citometria de fluxo para CD31 no dia 6.
  2. Indução do mesoderma lateral (dia 1-3)
    1. Aspire os meios de cultura iPSC de iPSCs plaqueados e adicione 3 mL de meio de base N2B27 suplementado com 6 μM de CHIR e 25 ng/mL BMP4 por poço (Arquivo Suplementar 1). Aqueça a mídia antes de adicioná-la às células. Não troque a mídia por 3 dias.
  3. Indução de células endoteliais (dia 4-5)
    1. No dia 4, aspire o meio N2B27 e adicione 2 mL de meio de diferenciação endotelial (EDM) suplementado com 200 ng/mL VEGF165 e 2 μM de forscolina por poço. Mude a mídia no dia 5.
  4. Classificação e replaqueamento de células endoteliais (Dia 6)
    1. No dia 5 ou 6, prepare um frasco T75 revestido com fibronectina para enriquecimento de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) reconstituindo 1 mg de fibronectina em água estéril para fazer 100 μg / mL de solução de fibronectina. Cubra o frasco T75 com 6 ml da solução de fibronectina e incube à temperatura ambiente durante uma hora. Aspire a solução de fibronectina e lave com água estéril. Deixar o balão T75 secar à temperatura ambiente. Os frascos suplementares fabricados podem ser conservados a 4 °C.
    2. Prepare meios de manutenção endotelial (EMM)18.
    3. No dia 6, enriqueça as células endoteliais derivadas de iPSC via FACS usando o anticorpo CD3118.
    4. Adicione 10 μM de ROCKi Y-27632 a cada poço uma hora antes da dissociação a 37 ° C. Aspire o meio e lave com PBS. Adicione 1 mL de solução de descolamento de células pré-aquecida por poço de uma placa de 12 poços e incube por 8-10 min a 37 ° C.
    5. Pipete suavemente para garantir o descolamento de uma única célula. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL e adicione o mesmo volume de Stop Media. Centrifugue por 5 min a 300 x g.
    6. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células endoteliais em 1 mL de Stop Media suplementado com 10 μM de ROCKi.  Passe as células pelo filtro de 70 μm adicionando primeiro 1 mL de meio de parada para molhar o filtro e, em seguida, pipetar as células através do filtro. Colher uma amostra de 10 μL para contagem de células utilizando um hemocitómetro e azul de tripano. Mantenha as células no gelo durante a contagem.
    7. Execute uma contagem de células. Preparar uma alíquota de 200.000 células como controlo negativo não corado. Transfira as células restantes para um tubo Eppendorf de 1,5 mL e adicione 10 μL de CD31-APC para cada 1 milhão de células em 100 μL de tampão FACS. Incubar durante 30 min num rotador a 4 °C.
    8. Uma vez concluída a incubação, centrifugue o tubo Eppendorf com células por 5 min a 300 x g, lave as células adicionando 1mL de PBS. Repita a etapa de lavagem e centrifugação duas vezes. Remova manualmente o sobrenadante entre as lavagens.
    9. Ressuspenda o pellet celular em 1mL de tampão FACS e 5 ug/mL de solução DAPI para coloração de viabilidade, 5 minutos antes da classificação. Classificar de acordo com as diretrizes institucionais.
    10. Colete células classificadas por FACS em um tubo cônico de 15 mL com 2 mL de EMM. Centrifugue o tubo cônico de 15 mL com células por 5 min a 300 x g. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células endoteliais em 10 mL de EMM suplementado com 10 μM de ROCKi Y-27632 e Penicilina Estreptomicina (1%).
    11. Transfira as células endoteliais derivadas de iPSC enriquecidas com FACS ressuspensas para o frasco revestido com fibronectina. Distribua uniformemente as células e coloque em uma incubadora a 37 ° C durante a noite.
      NOTA: Use um mínimo de 500.000 células e um máximo de 2.000.000 células por frasco T75.
  5. Expansão e criopreservação de células endoteliais selecionadas (Dia 7+)
    1. Altere a mídia EMM a cada 2-3 dias após o enriquecimento do FACS. Uma vez que o frasco T75 se torna confluente (aproximadamente 7 dias após o FACS, dependendo da densidade de semeadura), as células endoteliais derivadas de iPSC podem ser usadas para cocultura ou criopreservadas para aplicações futuras.
    2. Prepare uma solução de congelamento endotelial 2x antes da dissociação celular (80% Endo-CM2, 20% DMSO, 20 μM de ROCKi).
    3. Rotule os tubos crioviais em uma caneta à prova de etanol com as respectivas informações. ID da linha, número da passagem, meio de cultura, 'descongelar em um poço 6', data do congelamento.
    4. Quando as células endoteliais derivadas de iPSC classificadas são confluentes, inicie a dissociação.
    5. Lavar o balão T75 com 5ml de PBS -/-.
    6. Dissocie as células endoteliais derivadas de iPSC com 5mL de protease semelhante à tripsina por T75. Incube as células a 37 °C DURANTE 10 min, verificando periodicamente o T75 para verificar se as células foram levantadas.
    7. Neutralize a reação adicionando 5 mL de Stop Media. Transfira 10 mL de células em solução para tubo de 15 mL. Centrifugue a 300 x g por 5 min.
    8. Aspire o sobrenadante, ressuspenda as células endoteliais em meio E-CBM e retire 10 μL de amostra para contagem via hemacitómetro.
    9. Após a contagem de células, alíquota de 1 milhão de células por 0,5 mL de meio EGM2.
      NOTA: A etapa a seguir é sensível ao tempo. Prepare criogenials e recipientes de congelamento para serem usados imediatamente.
    10. Alíquota de volume igual de solução de congelamento 2x para células endoteliais. A concentração final é de 90% de Endo-CM2, 10% de DMO e 10 μM de ROCKi (1 mL/1 milhão de células).
    11. Transfira os frascos tampados imediatamente para uma câmara de congelamento e coloque a -80 ° C durante a noite, depois em nitrogênio líquido (-180 ° C) no dia seguinte para armazenamento de longo prazo.

3. Geração de macrófagos derivados de iPSC (Dia 1 - 26)

NOTA: Este procedimento descreve as etapas para gerar macrófagos a partir de iPSCs (Figura 1D), adaptado de van Wilgenburg et al.19 e Pouyanfard et al.20. Abrange a adaptação unicelular de iPSCs, diferenciação do corpo embrióide, formação de progenitores de macrófagos e maturação de macrófagos.

  1. Adaptação de iPSCs de célula única
    1. Quando as iPSCs atingirem ~ 70% -90% de confluência sem sinais visíveis de diferenciação, inicie a passagem de célula única com protease semelhante à tripsina.
    2. Aspire o meio gasto e enxágue com PBS. Remova o PBS e adicione protease semelhante à tripsina (1 mL / poço de uma placa de 6 poços, 500 μL / poço de uma placa de 12 poços). Incubar a 37 °C durante 2-5 min até que as colónias de iPSC se dissociem da placa.
    3. Neutralize a protease semelhante à tripsina com um volume igual de Stop Media (1 mL / poço de uma placa de 6 poços, 500 μL / poço de uma placa de 12 poços). Centrifugue as células a 200 x g por 5 min.
    4. Aspire o sobrenadante e ressuspenda suavemente as células em meios de cultura iPSC com 10 μM de ROCKi. Passagem para novas placas revestidas com ECM. Repita por 2-3 passagens antes de criopreservar ou usar as iPSCs adaptadas de célula única.
      NOTA: Ajuste a taxa de passagem de 1:2 para 1:10 com base na saúde e adaptação celular. Além disso, as iPSCs que sofreram pelo menos três passagens unicelulares e estão em baixa passagem produzem diferenciações ideais de macrófagos.
  2. Formação do corpo embrióide (Dia 0-6)
    1. Quando as iPSCs adaptadas a uma única célula atingem ~ 75% de confluência, as iPSCs de passagem com protease semelhante à tripsina de acordo com as etapas 3.1-3.4.
    2. Ressuspenda as células em Stop Media e passe por um filtro de células de 70 μm para um novo tubo cônico de 50 mL para remover aglomerados. Ressuspenda as células e colete uma amostra de 10 μL para contagem de células via hemacitômetro.
    3. Para a geração do corpo embrióide (EB), 8.000-50.000 células são plaqueadas por poço de uma placa de fixação ultrabaixa (ULA) de 96 poços. Calcule o número total de células necessárias para semear 60 poços de uma placa ULA de 96 poços.
      NOTA: A densidade de semeadura de iPSCs pode exigir otimização por linha celular.
    4. Centrifugue iPSCs em 15 mL cônicos a 200 x g por 5 min. Aspire o sobrenadante.
    5. Para 480.000 iPSCs (8.000 células/poço em 60 poços), ressuspenda em 6 mL (100 ul/poço em 60 poços) de meio de indução EB.
    6. Adicione 150 μL de PBS aos 36 poços externos de uma placa ULA de 96 poços de fundo redondo.
    7. Ressuspenda e transfira iPSCs em mídia EB para uma calha de mídia. Usando uma pipeta multicanal, adicione 100 μL / poço de suspensão celular nos 60 poços centrais da placa ULA de 96 poços. Ressuspenda as iPSCs em meio EB intermitentemente para garantir uma distribuição uniforme das células.
    8. Centrifugue a placa de 96 poços a 300 x g durante 5 min a 4 °C (se disponível). Transferir as placas para uma incubadora a 37 °C.
    9. Após 48-72 h, troque 50 μL do meio (troca de meio meio). Verifique a formação de cistos após 6 dias.
      NOTA: Algumas linhas iPSC formam EBs mais cedo ou mais facilmente do que outras. Monitore a formação de EB e certifique-se de que os EBs sejam transferidos no momento apropriado (eles devem estar desenvolvendo cistos).
  3. Revestimento de gelatina e transferência de EB para formação de progenitores de macrófagos (Dia 6-19)
    1. Prepare duas placas de 6 poços revestidas com gelatina a 0,1%. Adicione 1 mL de gelatina a 0,1% por poço e incube em temperatura ambiente por 20 min. Aspire a solução de gelatina e deixe as placas secarem no exaustor por 30-60 min.
    2. Transfira EBs da placa de 96 poços para as placas de 6 poços revestidas com gelatina usando uma pipeta sorológica de 2 mL. Distribua aproximadamente 8-10 EBs por poço de uma placa revestida de gelatina de 6 poços.
    3. Remova cuidadosamente a mídia EB residual usada da transferência. Adicione 2 mL de meio de cultura de macrófagos 1 (Mac-CM1) por poço. Incubar EB's sem perturbações a 37 °C com 5% de CO2 por 5-7 dias.
      NOTA: Idealmente, uma placa de 96 poços de corpos embrióides pode ser dividida em duas placas de 6 poços. Se os EBs forem pouco desenvolvidos, o número de EBs transferidos por placa de 6 poços pode ser ajustado para otimizar a etapa de diferenciação de iPSC para corpo embrióide.
  4. Geração de progenitores de macrófagos
    1. Substitua 2/3 da mídia duas vezes por semana, aumentando o volume para 3 mL se a cor da mídia mudar.
    2. Verifique as culturas entre os dias 8 e 19 para determinar se estão prontas para a colheita de progenitores de macrófagos. Se os EBs se soltarem, transfira os EBs para uma placa recém-revestida com Mac-CM1 e incube sem ser perturbado por 7 dias.
      NOTA: A manutenção do complexo formador de progenitores de macrófagos é vital para o desenvolvimento e geração contínua de progenitores de macrófagos. Complexos formadores de progenitores de macrófagos otimizados gerarão continuamente progenitores mielóides por 2-6+ meses.
  5. Colheita de progenitores mielóides (Dia 19-26+)
    1. Quando houver células progenitoras de macrófagos em suspensão, colha o meio com células e transfira para um tubo cônico de 50 mL. Centrifugue a 200 x g por 5 min e remova cuidadosamente o sobrenadante.
    2. Ressuspenda os progenitores de macrófagos em Mac-CM2 e transfira para uma placa/balão de cultura estéril não tratado. Incubar a 37 °C com 5% de CO2 por 3-4 dias.
      NOTA: Dependendo do número de células colhidas, transfira para uma placa de Petri de 10 cm (3-4 poços de uma placa de 6 poços), balão T25 (1-2 poços de uma placa de 6 poços) ou frasco T75 (placa cheia de 6 poços) com o volume apropriado de meio. Use 5-6 mL de meio para um frasco T25, 10-12 mL de meio em uma placa de Petri e 12-15 mL de meio para um frasco T75. Para colheitas subsequentes, progenitores mieloides e células de macrófagos podem ser agrupados de colheitas anteriores se forem da mesma linhagem/complexos formadores de mieloide. Apenas certifique-se de que o balão é suficiente para manter e alimentar o número de células no(s) frasco(s). Os macrófagos não proliferam; eles são gerados a partir de progenitores de macrófagos. Os macrófagos podem ser agrupados e mantidos por 2-6 semanas sem perder marcadores de expressão.
  6. Colheita de macrófagos
    NOTA: Após 14 dias de diferenciação de macrófagos em meio Mac-CM2, as culturas de macrófagos estão prontas para co-cultura ou análise de citometria de fluxo.
    1. Colete o meio gasto e transfira para um tubo cônico de 50 mL. Lave o balão / placa com PBS para remover os meios e células residuais.
    2. Adicione o meio de base ao frasco (3 ml para T25 e 5 ml para T75) e utilize um raspador de células esterilizado para separar as células do fundo do balão/placa. Transfira as células para um tubo cônico e repita a raspagem, se necessário.
    3. Centrifugue a 200 x g por 5 min em temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células em meio ou tampão apropriado para uso posterior.

4. Co-cultura de células das vias aéreas, células endoteliais e macrófagos

NOTA: Este procedimento descreve as etapas para a co-cultura de células das vias aéreas, células endoteliais e macrófagos (Figura 1A) usando insertos de cultura celular, adaptados de Costa et al.12.

  1. Revestimento ECM de insertos de cultura de células para co-cultura (Dia 0 de co-cultura)
    1. Cubra as inserções de cultura de células de poliéster (PET) de poros de 3,0 μm com solução de ECM de 4 mg/mL. Cubra brevemente o lado apical das inserções de cultura de células dentro da placa com 4 mg/mL de solução de MEC. Pipetar a solução residual de ECM. Coloque a placa na incubadora por 1 h a 37 °C.
    2. Obtenha uma placa de Petri grande (100 mm x 20 mm ou 150 mm x 20 mm). Com pinças limpas, transfira esterilizadamente as inserções de cultura de células da placa de 12 poços para a placa de Petri grande. Inverta as inserções para que o lado basolateral fique na vertical.
    3. Cubra o lado basolateral com 4 mg / mL de solução de ECM. Pipetar a solução residual de ECM. Coloque a placa de Petri com inserções de cultura de células revestidas com ECM em uma incubadora a 37 ° C para secar durante a noite.
  2. Dissociação e plaqueamento de células endoteliais derivadas de iPSC (Dia 1 de co-cultura)
    1. Lavar o balão T75 com PBS e aspirar a solução. Adicionar 5 ml de protease semelhante à tripsina ao balão T75 e incubar a 37 °C durante 8 min. Avalie visualmente se as células endoteliais foram retiradas do frasco.
      NOTA: Aumente o tempo de dissociação da protease semelhante à tipsina se as células endoteliais derivadas de iPSC não tiverem saído do frasco.
    2. Bata no frasco para garantir o descolamento das células endoteliais e transfira as células para um cônico de 15 mL. Adicione 5 mL de Stop Media para interromper a dissociação. Centrifugue as células a 300 x g por 5 min.
    3. Aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio de cultura endotelial com 10 μM de ROCKi. Obtenha 10 μL de solução ressuspensa para contagem de células e coloque as células no gelo durante a contagem.
    4. Use 150.000 células endoteliais iPSC por inserção de cultura de células de 12 mm em 100 μL de meio de cultura endotelial. Ajuste o respectivo volume de mídia para atingir o número desejado de células por inserção.
    5. Obtenha uma placa de Petri com inserções de cultura de células de 3,0 μm revestidas com ECM da incubadora (consulte as etapas 4.1-4.3).
    6. Ressuspenda as células endoteliais iPSC e pipete 100 μL com 150.000 células no inserto de cultura de células invertido (lado basolateral voltado para cima). Repetir pipetagem para cada uma das pastilhas preparadas
    7. Transfira cuidadosamente as células para a incubadora e deixe-as intactas por 3 h.
    8. Em uma placa de 12 poços, adicione 1 mL de meio de cultura endotelial em cada poço (para o respectivo número de insertos de cultura de células preparados).
    9. Retire a placa de Petri com células endoteliais da incubadora. Usando uma pinça limpa, transfira cuidadosamente as inserções de cultura de células para a placa com meios de cultura endoteliais (virando a inserção para que o fundo fique voltado para baixo na mídia).
    10. Verifique visualmente em um microscópio se as células endoteliais aderiram. Colocar a placa numa incubadora a 37 °C durante a noite.
  3. Dissociação e plaqueamento de organoides das vias aéreas derivados de iPSC (Dia 2 de co-cultura)
    NOTA: Consulte as etapas 1.1.1-1.1.15 para isolamento de organoides das vias aéreas do polímero ECM. Modifique a duração da dissociação da protease semelhante à tripsina (etapa 1.1.10) para 15-20 min para obter a suspensão de célula única.
    1. Após 15-20 min, interrompa a reação de protease semelhante à tripsina adicionando 3 mL de Stop Media. Ressuspenda a solução com uma pipeta P1000 e centrifugue a 400 x g por 5 min.
    2. Aspire o sobrenadante e ressuspenda os organoides das vias aéreas em 1 mL de meio de expansão das vias aéreas com 10 μM de ROCKi. Pegue uma amostra de 10 μL para uma contagem de células do hemaciotômetro e coloque as células no gelo durante a contagem.
    3. Semeie 300.000 células iPSC das vias aéreas em 500 μL de meio de expansão das vias aéreas por inserto de cultura de células de 12 mm. Ajuste o respectivo volume de mídia para atingir o número desejado de células por inserto preparado.
    4. Remover a placa com inserções de cultura de células com células endoteliais (semeadas no lado basolateral) da incubadora a 37 °C.
    5. Ressuspenda as células das vias aéreas iPSC e pipete 500 μL com 300.000 células na câmara apical de cada inserto de cultura de células. Colocar a placa numa incubadora a 37 °C durante 48 h com as células apicais em condições líquido-líquido.
  4. Co-cultura de transporte aéreo (Dia 4 de co-cultura)
    1. Remova o meio do lado apical do inserto de cultura de células. Altere os meios basolaterais para meios de diferenciação das vias aéreas 1:1 e meios de cultura endotelial. Retorne a placa para a incubadora.
  5. Dissociação e plaqueamento de macrófagos derivados de iPSC (Dia 5 de co-cultura)
    1. Dissociar os macrófagos derivados de iPSC do balão utilizando um raspador de células (ver passos 3.22-3.24). Centrifugue a 300 x g por 5 min e aspire o sobrenadante.
    2. Ressuspenda macrófagos iPSC em 1 mL de Mac-CM2. Pegue uma amostra de 10 μL para contagem de células e coloque as células no gelo durante a contagem. O número de macrófagos espelhará o número de células das vias aéreas semeadas (proporção de 1:1 de macrófagos para células das vias aéreas).
    3. Após a contagem de células, alíquotas de 300.000 macrófagos em meio de 35 μL por poço de cultura de células preparada são inseridas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Centrifugue a 200 x g por 5 min.
    4. Após centrifugação, pipetar o sobrenadante. Ressuspenda os macrófagos no respectivo Mac-CM2 dos cálculos.
    5. Remova as inserções com coculturas de células endoteliais e das vias aéreas da incubadora. Semeie 300.000 macrófagos em 35 μL de Mac-CM2 no lado apical da inserção da cultura de células. Colocar a placa numa incubadora a 37 °C durante 48 h.
      NOTA: Para confirmar a adesão das células imunes ao iPSC ao inserto da cultura celular, as células podem ser marcadas com uma sonda fluorescente. Confirme a adesão por meio de microscopia para sinal fluorescente 48 h após o plaqueamento de macrófagos.
  6. Co-cultura tripla (7º dia de co-cultura)
    1. Certifique-se de que a cocultura esteja pronta para aplicações a jusante, como estudos de infecção, medições de resistência elétrica transepitelial (TEER) e ensaios de integridade de barreira.

Resultados

Existem vários estágios nos quais a diferenciação de organoides das vias aéreas derivadas de iPSC, células endoteliais, células imunes e co-culturas pode ser avaliada como concluída com sucesso. As diferenciações podem ser realizadas em diferentes linhagens de iPSC, e este protocolo foi testado em pelo menos cinco linhagens diferentes. O protocolo precisa ser adaptado a cada nova linha de iPSC, especificamente modificando e otimizando a densidade de semeadura.

Discussão

O desenvolvimento e a implementação de um modelo da barreira sangue-ar nas grandes vias aéreas para estudar infecções virais e outras toxinas requerem atenção meticulosa aos detalhes para garantir a diferenciação e função bem-sucedidas dos vários tipos de células envolvidas. Esta discussão abordará os principais fatores para uma diferenciação bem-sucedida, desafios potenciais, aplicações alternativas e implicações para o estudo de doenças humanas.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pela CIRM (DISC2COVID19-12022).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
12 well platesCorning3512
12-well inserts, 0.4 µm, translucent VWR10769-208
2-mercaptoethanol Sigma-AldrichM3148
AccutaseInnovative Cell TechAT104
Activin AR&D Systems338-AC
All-trans retinoic acid (RA) Sigma-AldrichR2625
ascorbic acidSigmaA4544
B27 without retinoic acid ThermoFisher12587010
BMP4 R&D Systems314-BP/CF
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution Gibco15260-037
Br-cAMPSigma-AldrichB5386
CD 14 (FITC)BioLegend982502
CD 31 PECAM-1(APC)R&D SystemFAB3567A
CD 45 (PE)BD Biosciences560975
CD 68 (PE)BioLegend33808
CHIR99021 Abcamab120890
CPMFujifilm014-27501
Dexamethasone Sigma-AldrichD4902
Dispase StemCellTech7913
DMEM/F12 Gibco10565042
DorsomorphinR&D Systems3093
E-CAD/CD 324 (APC)BioLegend324107
EGFR&D Systems236-EG
EGM2 MediumLonzaCC-3162
EPCAM/CD 326 (APC)BioLegend324212
FBS Gibco10082139
FGF10R&D Systems345-FG/CF
FGF7R&D Systems251-KG/CF
FibronectinFisher356008
ForskolinAbcamab120058
Glutamax Life Technologies35050061
Ham’s F12 Invitrogen11765-054
HEPESGibco15630-080
IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)Sigma-AldrichI5879
IL-3Peprotech200-03
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax Invitrogen31980030
Knockout Serum Replacement (KSR)Life Technologies10828028
MatrigelCorning354230
M-CSFPeprotech 300-25
Monothioglycerol SigmaM6145
mTeSR plus Kit (10/case)Stem Cell Tech5825
N2 ThermoFisher17502048
NEAALife Technologies11140050
PBSGibco10010023
Pen/strepLonza17-602F
ReleSRStem Cell Tech5872
RPMI1640 + Glutamax Life Technologies12633012
SB431542 R&D Systems1614
SCFPeproTech300-07
SMAInvitrogen50-9760-80
STEMdiff APEL 2 MediumSTEMCELL Technologies5275
TrypLE ExpressGibco12605-028
VEGF165Preprotech100-20
VimentinCell Signaling5741S
Y-27632 (Rock Inhibitor) R&D Systems1254/1
ZO-1Invitrogen339100

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