폐 건강 및 질환에서 기도 장벽 무결성을 모델링하기 위한 iPSC 유래 상피, 중간엽, 내피 및 면역 세포 공동 배양

요약

이 논문에서는 공기-액체 계면 배양에서 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 폐 상피, 중간엽, 내피 세포 및 대식세포로 구성된 복잡한 다세포 기도 장벽 모델의 생성에 대해 설명합니다.

초록

인간의 폐 조직은 비인두의 상기도에서 가장 작은 폐포낭까지 상피, 중간엽, 내피 및 면역 세포의 상호 연결된 네트워크로 구성되어 있습니다. 이러한 세포 간의 상호 작용은 폐 발달과 질병에 매우 중요하며 유해한 화학 물질 및 병원체에 대한 장벽 역할을 합니다. 현재의 체외 공동 배양 모델은 생물학적 배경이 다른 불멸화된 세포주를 사용하는데, 이는 폐의 세포 환경이나 상호 작용을 정확하게 나타내지 못할 수 있습니다. 인간 iPSC를 3D 폐 오가노이드(상피와 중간엽을 모두 포함), 내피 세포 및 대식세포로 분화했습니다. 이들은 대식세포와 기저외측 내피 장벽(iAirway)이 투자된 상피/중간엽 정점 장벽을 형성하기 위해 공기-액체 계면(ALI) 형식으로 공동 배양되었습니다. iPSC에서 유래한 iAirways는 호흡기 바이러스 및 담배 독소 감염에 대한 반응으로 장벽 무결성이 감소하는 것으로 나타났습니다. 이 다중 계통 폐 공동 배양 시스템은 폐 발달, 항상성 및 질병 진행의 기초가 되는 세포 상호 작용, 신호 경로 및 분자 메커니즘을 연구하기 위한 플랫폼을 제공합니다. iAirways는 인간의 생리학 및 세포 상호 작용을 밀접하게 모방하고, 환자 유래 iPSC에서 생성될 수 있으며, 기도의 다양한 세포 유형을 포함하도록 사용자 정의할 수 있습니다. 전반적으로 iPSC에서 파생된 iAirway 모델은 질병, 병원체 반응, 면역 조절 및 약물 발견 또는 체외 용도 변경에 대한 유전적 동인을 더 잘 이해하기 위해 장벽 무결성을 연구하기 위한 다재다능하고 강력한 도구를 제공하며, 기도 질환에 대한 이해와 치료를 발전시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

서문

대기도의 혈액-공기 장벽에는 기관, 기관지, 세기관지가 포함됩니다. 호흡기 건강을 유지하는 데 중요한 역할을 하며 기도 상피, 기저막, 혈관 및 내피 세포, 면역 세포로 구성됩니다. 기도의 주요 상피 세포는 기저 세포, 클럽 세포, 섬모 세포 및 배상 세포를 포함합니다. 기도 상피의 줄기세포 역할을 하는 기저세포는 높은 증식 및 자가 재생 능력을 가진 다분화능 전구세포로, 성숙한 기도 상피세포를 생성합니다¹. 곤봉 세포는 섬모가 없는 분비 세포로, 보호 단백질과 계면활성제를 분비하여 기도 내벽의 유지에 기여합니다². 내강과 점막하샘에 위치한 배상세포(goblet cell)는 점액을 분비하여 파편을 가두고 기도를 보호합니다³. 섬모 세포는 점액섬모 에스컬레이터 메커니즘에 필수적이며, 유해한 미생물의 축적을 방지한다⁴. 기저막은 구조적 지지를 제공하는 세포외 기질(extracellular matrix)로 구성되어 있다⁵. 기관과 기도의 나머지 부분은 풍부한 혈관 네트워크로 둘러싸여 있으며, 혈관에는 영양분과 산소를 공급하고, 노폐물을 제거하고, 염증을 조절하고, 조직 복구 및 혈관 신생에 기여함으로써 기관 기능을 지원하는 데 중요한 역할을 하는 내피 세포가 늘어서 있습니다⁶. 마지막으로, 기도 대식세포는 조직 특이적 면역 세포로, 호흡기를 감염으로부터 보호하고, 흡입된 입자를 제거하며, 균형 잡힌 면역 반응을 유지하는 데 필수적입니다⁷.

상피세포(epithelial), 중간엽세포(mesenchymal), 내피세포(endothelial cell) 및 대식세포세포(macrophage cell)의 조정된 작용은 기도의 병원체에 대한 효과적인 면역 반응에 매우 중요합니다⁸. 상피 세포는 물리적 장벽 역할을 하여 바이러스 감염에 대한 1차 방어선을 형성하며, 단단한 접합부는 유해 물질의 통과를 제한합니다. 섬모 세포와 배상 세포의 조화로운 작용은 흡입된 입자, 병원체 및 파편을 가두고 제거하는 데 도움이 됩니다⁴. 또한 기도 상피 세포는 사이토카인(cytokine)과 케모카인(chemokine)을 생성하여 면역 세포를 모집합니다⁹. 내피 세포는 혈관 무결성을 유지하여 혈류를 통한 바이러스 입자의 확산을 방지하고, 접착 분자(VCAM-1)를 상향 조절하여 면역 세포 접착을 촉진하고, 혈류에서 감염 부위로 면역 세포를 모집하기 위해 전염증성 사이토카인을 생성합니다¹⁰. 기도 대식세포는 바이러스 입자, 감염된 세포 및 파편을 삼켜 소화하고, T 세포에 바이러스 항원을 제시하고, 바이러스 복제를 억제하기 위해 I형 인터페론과 함께 다른 면역 세포를 활성화하고 동원하기 위해 사이토카인을 생성합니다¹¹. 상피세포, 중간엽세포, 내피세포, 대식세포 세포의 조화로운 작용은 바이러스 감염으로부터 기도를 보호하고 호흡기 건강을 유지하는 강력하고 역동적인 방어 시스템을 만듭니다.

인간 폐의 다양한 세포 유형 간의 동적 상호 작용을 이해하는 것은 바이러스 감염, 염증성 질환 및 약물 전달에 대한 폐의 반응을 이해하는 데 매우 중요합니다. 체외 공동 배양은 상피, 내피 세포 및 선천성 면역 세포 사이의 세포-세포 신호 전달을 연구할 수 있도록 합니다¹². 우리는 환자 특이적 hiPSC에서 유래한 최초의 진정한 다세포형 폐 모델을 개발했습니다¹³. 이것은 3D 방향으로 형성된 상피 및 중간엽 세포 집단을 모두 통합합니다. 그 후, 폐 전구 세포는 "기도 오가노이드"¹⁴로 분화될 수 있고, 멸균 세포 배양 삽입물에 배양되고, 인간의 기도 조건을 복제하는 공기-액체 계면(ALI)에 노출될 수 있습니다 15,16,17. iPSC 유래 내피 세포는 막의 기저측 쪽에서 배양되며, 기저막의 상피/중간엽 층 아래에 위치한 인간의 기도에서의 방향을 모방합니다. 마지막으로, iPSC 유래 대식세포는 막의 정점 쪽에 추가되어 상피 세포와 상호 작용하고 활성화 신호를 기다립니다(그림 1A). 이 모델은 기도의 생물학과 기능을 정확하게 재현합니다. 우리는 hiPSC에서 유래한 환자 특이적, 진정한 다세포 유형 iAirway 배양이 바이러스 감염을 포함한 기도 장벽 및 병원체의 내재적이고 급성 반응을 밝히는 데 가장 적합하다고 가정합니다. 예를 들어, 이 모델은 (1) 바이러스 진입 및 복제를 연구하고, (2) 상피 및 조직 특이적 면역 세포에 의한 초기 면역 반응을 조사하고, (3) 장벽 무결성 및 기능을 검사하고, (4) 치료제의 효능을 테스트하고, (5) 환자 특이적 모델에서 발병의 세포 및 분자 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

이 논문은 바이러스 감염에 대한 세포 반응을 연구하기 위해 다세포 폐 공동 배양을 준비하기 위한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다.

프로토콜

이 연구 프로토콜은 UCSD의 인간 연구 보호 프로그램(Human Research Protections Program)의 기관 검토 위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다(181180). 이 프로토콜은 작은 분자와 성장 인자를 사용하여 만능 줄기 세포를 기도 세포, 내피 세포 및 대식 세포로 분화하도록 지시합니다. 그런 다음 이러한 세포는 세포 배양 삽입체에서 공동 배양되고 공기-액체 계면에서 분극화됩니다. 사용된 시약, 소모품 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다. 매체 및 완충액 조성물은 보충 파일 1에 제공된다.

1. iPSC 유래 기도 오가노이드 생성 (Day 1 - 30)

참고: 이 프로토콜은 Leibel et ^al.13에 설명된 방법론에 따라 iPSC 유래 기도 오가노이드(그림 1B)를 생성하는 데 필요한 단계를 간략하게 설명합니다. 이 과정에는 최종 내배엽 유도(1-3일차), 전방 앞장 내배엽 생성(4-6일차), 폐 전구세포로의 분화(7-16일차)가 포함됩니다. 자세한 방법론은 이전 출판물¹³에서 확인할 수 있습니다. 다음 단계는 폐 전구세포에서 기도 오가노이드(airway organoid)의 생성에 대해 자세히 설명합니다.

1. ECM 폴리머에서 폐전구 스페로이드 추출 및 해리(17일차)
   1. 얼음에서 세포외 기질(ECM) 폴리머(8-9mg/mL)를 해동합니다.
   2. 진공 흡입기를 사용하여 ECM에 내장된 폐 오가노이드에서 사용한 배지를 흡입합니다.
      알림: 후속 흡인 단계에서는 달리 명시되지 않는 한 진공 흡인기를 사용하십시오.
   3. 10μM의 ROCK1 억제제(ROCKi)가 보충된 2U/mL 디스페이즈 1mL를 세포에 추가하고 P1000 피펫을 사용하여 ECM에서 폐 전구세포를 수동으로 재현탁합니다. 37°C에서 30분 동안 배양하고 15분마다 혼합물을 재현탁시켜 기계적 처리를 통한 디스페이스 해리 효율을 향상시킵니다.
   4. 사용 15분 전에 실온 PBS 45mL를 -20°C 냉동고에 넣어 식힙니다. 후속 단계에서 최적의 ECM 해중합을 위해 PBS가 4°C보다 낮은지 확인하십시오.
   5. 30분 분간 배양 후 오가노이드와 디스페이즈 용액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
   6. 냉각된 PBS(프로테아제 1mL당 2mL)를 추가하여 플레이트에 잔류 오가노이드 및 ECM 물질을 세척하고 수집합니다. P1000 피펫과 원심분리기를 사용하여 400 x g 에서 5분 동안 오가노이드를 재현탁합니다.
      참고: 모든 원심분리 단계는 이 프로토콜에 달리 명시되지 않는 한 실온에서 수행됩니다.
   7. 원심분리 후 오가노이드가 있는 흐린 ECM 펠릿이 보여야 합니다. ECM 펠릿을 피하면서 피펫을 통해 상등액을 조심스럽게 흡입합니다.
   8. 냉각된 PBS로 두 번째 PBS 세척을 수행하고 P1000 피펫을 사용하여 다시 현탁한 다음 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 피펫 을 통해 상등액을 흡입하고 ~100 μL의 잔류 용액을 남깁니다.
   9. 트립신 유사 프로테아제 2mL를 15mL 원뿔형 튜브의 오가노이드에 추가합니다. P1000 피펫을 사용하여 재현탁합니다. 37 ° C에서 10-12 분 동안 배양하고 튜브를 뒤집거나 튕겨 배양 중간에 혼합물을 다시 현탁시킵니다.
      참고: 10-12분 동안 트립신 유사 단백질 분해를 수행하여 오가노이드를 응집체로 전달합니다.
   10. 12분 후, 염기 배지에 2% FBS 2mL를 첨가하여 트립신 유사 단백질 분해 효소 반응을 중단합니다(배지 중지, 보충 파일 1 참조). P1000 피펫과 원심분리기로 400 x g 에서 5분 동안 용액을 재현탁합니다.
   11. 상층액을 흡인하고 10μM의 ROCKi가 보충된 Stop Media에서 오가노이드를 재현탁합니다. 혈구계와 트리판 블루를 사용하여 세포 계수를 위해 10μL 샘플을 채취합니다. 카운트하는 동안 오가노이드를 얼음 위에 두십시오.
   12. 웰당 100,000개의 세포를 얻는 데 필요한 부피를 계산합니다. 부분 표본 세포는 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브와 400 x g에서 5분 동안 원심분리로 응집됩니다. 과도한 상층액을 제거하고 10μL의 잔류 매체를 남깁니다.
   13. 세포 펠릿을 200μL의 저온 ECM 폴리머에 재현탁시킵니다(기포를 피하고 조기 중합을 방지하기 위해 빠르게 작업). ECM 및 세포 혼합물 200μL를 12웰 플레이트의 각 웰 바닥에 추가합니다. ECM이 생물 안전 작업대에서 실온에서 5분 동안 부분적으로 중합되도록 합니다.
   14. 플레이트를 37°C 인큐베이터로 30-60분 동안 옮겨 ECM 중합을 완료합니다. 그런 다음 1.5mL의 기도 오가노이드 유도 배지(보충 파일 1)를 추가합니다.
   15. 30일째까지 14일 동안 격일로 매체를 변경합니다. 매체가 24시간 이내에 노란색으로 변하면 부피를 2mL로 늘립니다.

2. iPSC 유래 내피 세포의 생성 (Day 1 - 14)

참고: 다음 절차는 Patsch et ^al.18에서 발췌한 iPSC에서 내피 세포를 생성하는 방법에 대해 자세히 설명합니다(그림 1C). 이 방법에는 플레이트 준비, iPSC 분화, 내피 세포 유도, 분류 및 증식이 포함됩니다. 표 1은 이 연구에 사용된 항체를 나열합니다.

1. 내피 분화를 위한 iPSC 도금(0일차)
   1. hiPSC가 70%-80% 포화도에 도달할 때 내피 세포 분화를 시작합니다. 해리 한 시간 전에 각 웰에 10μM의 ROCKi Y-27632를 추가합니다.
   2. 배지를 흡입하고 1mL의 PBS로 웰을 세척한 다음 12웰 플레이트의 웰당 1mL의 세포 분리 용액을 추가하여 iPSC를 해리합니다. 37 °C에서 20분 동안 배양합니다.
   3. 웰에 2mL의 Stop Media를 추가하여 세포 분리 용액을 중화합니다. 단일 세포 현탁액을 얻기 위한 피펫. 세포를 15mL 코니컬 튜브로 옮기고 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
   4. 상층액을 흡인하고, 10μM의 ROCKi가 보충된 iPSC 배양 배지에 iPSC를 재현탁하고, 세포 계수를 수행합니다. 10μM의 ROCKi가 포함된 1mL의 iPSC 배양 배지에 ECM 코팅된 12웰 플레이트의 웰당 100,000개의 hiPSC를 플레이트화합니다. 37 °C에서 밤새 배양합니다.
      참고: iPSC-내피 분화를 위한 시딩 밀도는 세포주별로 최적화가 필요할 수 있습니다. 6일차에 CD31에 대한 유세포분석을 사용하여 차별화 효율을 평가합니다.
2. 측면 중배엽 유도 (1-3일차)
   1. 플레이트된 iPSC에서 iPSC 배양 배지를 흡입하고 웰당 6μM의 CHIR 및 25ng/mL BMP4가 보충된 3mL의 N2B27 기본 배지를 추가합니다(보충 파일 1). 세포에 추가하기 전에 미디어를 따뜻하게 합니다. 3일 동안 미디어를 교체하지 마십시오.
3. 내피 세포 유도 (4-5일차)
   1. 4일차에 N2B27 배지를 흡인하고 웰당 200ng/mL VEGF165과 2μM의 포스콜린이 보충된 2mL의 내피 분화 배지(EDM)를 추가합니다. 5일차에 미디어를 변경합니다.
4. 내피 세포 분류 및 리플레팅(6일차)
   1. 5일 또는 6일차에 1mg의 피브로넥틴을 멸균수에서 재용해하여 100μg/mL의 피브로넥틴 용액을 만들어 형광 활성화 세포 분류(FACS) 농축을 위해 피브로넥틴 코팅된 T75 플라스크를 준비합니다. T75 플라스크에 6mL의 피브로넥틴 용액을 코팅하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 피브로넥틴 용액을 흡입하고 멸균수로 씻어냅니다. T75 플라스크를 실온에서 건조시킵니다. 만든 여분의 플라스크는 4 °C에서 보관할 수 있습니다.
   2. 내피 유지 매체(EMM)를 준비합니다^.18.
   3. 6일차에는 CD31 항체¹⁸을 사용하여 FACS를 통해 iPSC 유래 내피 세포를 농축합니다.
   4. 37°C에서 해리하기 한 시간 전에 각 웰에 10μM의 ROCKi Y-27632를 추가합니다. 매체를 흡입하고 PBS로 세척합니다. 12-well 플레이트의 웰당 예열된 세포 분리 용액 1mL를 추가하고 37°C에서 8-10분 동안 배양합니다.
   5. 단세포 분리를 보장하기 위해 부드럽게 피펫팅합니다. 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 동일한 부피의 Stop Media를 추가합니다. 300 x g에서 5분간 원심분리기를 사용합니다.
   6. 상층액을 흡인하고 10μM의 ROCKi가 보충된 1mL Stop Media에서 내피 세포를 재현탁합니다.  먼저 1mL의 정지 매체(stop media)를 추가하여 필터를 적시고 필터를 통해 세포를 피펫팅하여 70μm 필터에 세포를 통과시킵니다. 혈구계와 트리판 블루를 사용하여 세포 계수를 위해 10μL 샘플을 채취합니다. 계수하는 동안 세포를 얼음 위에 두십시오.
   7. 셀 계수를 수행합니다. 200,000개의 세포로 구성된 부분 표본을 염색되지 않은 음성 대조군으로 준비합니다. 나머지 세포를 1.5 mL Eppendorf tube에 옮기고 100 μL의 FACS 완충액에 세포 100만 개당 10 μL의 CD31-APC를 추가합니다. 4 °C의 회전기에서 30분 동안 배양합니다.
   8. 배양이 완료되면 Eppendorf 튜브를 300 x g에서 5분 동안 원심분리하고 PBS 1mL를 첨가하여 세포를 세척합니다. 세척 및 원심분리 단계를 두 번 반복합니다. 세탁 사이에 상층액을 수동으로 제거하십시오.
   9. 분류 5분 전에 생존도 염색을 위해 1mL의 FACS 완충액과 5ug/mL DAPI 용액에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 교육기관 지침에 따라 정렬합니다.
   10. 2mL의 EMM이 있는 15mL 코니컬 튜브에서 FACS로 분류된 세포를 수집합니다. 15mL 원뿔형 튜브와 셀이 있는 튜브를 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 10μM의 ROCKi Y-27632 및 페니실린 스트렙토마이신(1%)이 보충된 EMM 10mL에서 내피 세포를 재현탁합니다.
   11. 재현탁된 FACS가 풍부한 iPSC 유래 내피 세포를 피브로넥틴 코팅된 플라스크로 옮깁니다. 세포를 고르게 분포시키고 37°C 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓습니다.
       참고: T75 플라스크당 최소 500,000개 및 최대 2,000,000개 셀을 사용합니다.
5. 분류된 내피 세포의 확장 및 동결 보존(Day 7+)
   1. FACS 보강 후 2-3일마다 EMM 미디어를 변경합니다. T75 플라스크가 합류하면(파산 후 약 7일, 시딩 밀도에 따라 다름) iPSC 유래 내피 세포를 공동 배양 또는 향후 응용 분야를 위해 동결 보존하는 데 사용할 수 있습니다.
   2. 세포 해리 전에 2x 내피 동결 용액(80% Endo-CM2, 20% DMSO, 20μM ROCKi)을 준비합니다.
   3. cryovial tubes에 에탄올 방지 펜에 해당 정보와 함께 라벨을 붙입니다. 라인 ID, 통과 번호, 배양 매체, '6 우물로 해동', 동결 날짜.
   4. 분류된 iPSC 유래 내피 세포가 합류하면 해리가 시작됩니다.
   5. T75 플라스크에 PBS -/-를 5ml로 세척합니다.
   6. iPSC 유래 내피 세포를 T75당 5mL의 트립신 유사 프로테아제로 해리합니다. 37°C에서 10분 동안 세포를 배양하고 T75를 주기적으로 확인하여 세포가 들어올랐는지 확인합니다.
   7. 5mL의 Stop Media를 첨가하여 반응을 중화합니다. 용액 내 세포 10mL를 15mL 튜브로 옮깁니다. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리기
   8. 상층액을 흡인하고, E-CBM 배지에서 내피 세포를 재현탁하고, 혈구계를 통해 10μL 샘플을 채취하여 계수합니다.
   9. 세포 계수 후 EGM2 배지 0.5mL당 100만 개의 세포를 분주합니다.
      참고: 다음 단계는 시간에 민감합니다. 즉시 사용할 수 있도록 냉동 용기 및 냉동 용기를 준비하십시오.
   10. 내피 세포에 대한 2x 동결 용액의 부분 표본 동일 부피. 최종 농도는 90% Endo-CM2, 10% DMO 및 10μM의 ROCKi(1mL/100만 개 세포)입니다.
   11. 뚜껑을 씌운 바이알을 즉시 냉동 챔버로 옮기고 -80°C에서 하룻밤 동안 보관한 다음 다음 날 액체 질소(-180°C)에 넣어 장기 보관합니다.

3. iPSC 유래 대식세포의 생성 (Day 1 - 26)

참고: 이 절차는 van Wilgenburg et ^al.19 및 Pouyanfard et ^al.20에서 채택한 iPSC에서 대식세포를 생성하는 단계를 간략하게 설명합니다(그림 1D). 여기에는 iPSC의 단세포 적응, 배아체 분화, 대식세포 전구 형성 및 대식세포 성숙이 포함됩니다.

1. iPSC의 단일 세포 적응
   1. iPSC가 눈에 띄는 분화 징후 없이 ~70%-90% 포화도에 도달하면 트립신 유사 단백질 분해 효소로 단세포 배양을 시작합니다.
   2. 사용한 미디어를 흡입하고 PBS로 헹굽니다. PBS를 제거하고 트립신 유사 프로테아제(6웰 플레이트의 1mL/웰, 12웰 플레이트의 500μL/웰)를 추가합니다. iPSC 콜로니가 플레이트에서 분리될 때까지 37°C에서 2-5분 동안 배양합니다.
   3. 동일한 부피의 Stop Media(6-well 플레이트의 1 mL/well, 12-well plate의 500 μL/well)로 trypsin-like protease를 중화합니다. 200 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.
   4. 상층액을 흡인하고 10μM의 ROCKi로 iPSC 배양 배지에서 세포를 부드럽게 재현탁합니다. 새로운 ECM 코팅 플레이트로 이동합니다. 동결 보존하거나 단일 세포 적응 iPSC를 사용하기 전에 2-3 계대에 대해 반복합니다.
      참고: 세포 건강과 적응에 따라 통과 비율을 1:2에서 1:10으로 조정합니다. 또한, 최소 3번의 단세포 계대를 거치고 낮은 계대 경에 도달한 iPSC는 최적의 대식세포 분화를 생성합니다.
2. 배아체 형성 (Day 0-6)
   1. 단세포 적응 iPSC가 ~75% 포화도에 도달하면 단계 3.1-3.4에 따라 트립신 유사 단백질 분해 효소와 함께 iPSC를 계대시킵니다.
   2. Stop Media에서 세포를 재현탁하고 70μm 세포 여과기를 통해 새로운 50mL 원뿔형 튜브에 통과시켜 덩어리를 제거합니다. 세포를 재현탁하고 혈구계 를 통해 세포 계수를 위해 10μL 샘플을 채취합니다.
   3. 배아체(EB) 생성을 위해 96웰 ULA(Ultra-Low Attachment) 플레이트의 웰당 8,000-50,000개의 세포가 도금됩니다. 96웰 ULA 플레이트의 60웰에 파종하는 데 필요한 총 세포 수를 계산합니다.
      참고: iPSC의 seeding density는 세포주당 최적화가 필요할 수 있습니다.
   4. 15mL 원뿔형 원뿔형 iPSC를 200 x g 에서 5분 동안 가열합니다. 상층액을 흡인합니다.
   5. 480,000 iPSC(60웰 내 8,000개 세포/웰)의 경우 6mL(60웰 내 100ul/웰) EB 유도 배지에 재현탁합니다.
   6. 둥근 바닥 96웰 ULA 플레이트의 36개 외부 웰에 150μL의 PBS를 추가합니다.
   7. EB 배지의 iPSC를 재현탁 및 배지 트로프로 전송합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 100μL/well의 세포 현탁액을 96웰 ULA 플레이트의 중앙 60웰에 추가합니다. 세포의 균일한 분포를 보장하기 위해 EB 배지에 iPSC를 간헐적으로 재현탁합니다.
   8. 96웰 플레이트를 300 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리(사용 가능한 경우). 플레이트를 37°C 인큐베이터로 옮깁니다.
   9. 48-72시간 후 매체의 50μL를 교체합니다(절반 매체 교체). 6일 후 낭종 형성을 확인하십시오.
      참고: 일부 iPSC 라인은 다른 라인보다 더 일찍 또는 더 쉽게 EB를 형성합니다. EB 형성을 모니터링하고 EB가 적절한 시점에 전달되었는지 확인합니다(낭종이 발생해야 함).
3. 대식세포 전구세포 형성을 위한 젤라틴 코팅 및 EB 전달(6-19일차)
   1. 0.1% 젤라틴으로 코팅된 6웰 플레이트 2개를 준비합니다. 웰당 0.1% 젤라틴 1mL를 추가하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 젤라틴 용액을 흡입하고 플레이트를 후드에서 30-60분 동안 건조시킵니다.
   2. 2mL 혈청학 피펫을 사용하여 96웰 플레이트에서 젤라틴 코팅된 6웰 플레이트로 EB를 옮깁니다. 6웰 젤라틴 코팅 플레이트의 웰당 약 8-10EB를 분배합니다.
   3. 전송에서 사용된 잔여 EB 매체를 조심스럽게 제거합니다. 웰당 2mL의 대식세포 배양 배지 1(Mac-CM1)을 추가합니다. EB를 37 ° C에서 5 % CO₂ 로 5-7 일 동안 방해받지 않고 배양하십시오.
      참고: 이상적으로는 배아체의 96웰 플레이트 하나를 두 개의 6웰 플레이트로 분할할 수 있습니다. EB가 제대로 개발되지 않은 경우, 6-well 플레이트당 전달되는 EB의 수를 조정하여 iPSC에서 배아체로의 분화 단계를 최적화할 수 있습니다.
4. 대식세포 전구 생성
   1. 일주일에 두 번 매체의 2/3를 교체하고 매체 색상이 변하면 부피를 3mL로 늘립니다.
   2. 8일에서 19일 사이에 배양물을 확인하여 대식세포 전구 수확을 할 준비가 되었는지 확인합니다. EB가 분리되면 Mac-CM1이 있는 갓 코팅된 플레이트에 EB를 옮기고 7일 동안 방해받지 않고 배양합니다.
      참고: 대식세포 전구 형성 복합체의 유지는 대식세포 전구세포의 발달과 지속적인 생성에 필수적입니다. 최적화된 대식세포 전구세포 형성 복합체는 2-6+ 개월 동안 지속적으로 골수성 전구세포를 생성합니다.
5. 골수성 전구 세포 채취 (19-26+일차)
   1. 현탁액에 대식세포 전구 세포가 있는 경우, 세포가 있는 배지를 수확하여 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 200 x g 에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
   2. Mac-CM2에서 대식세포 전구세포를 재현탁하고 처리되지 않은 멸균 배양 접시/플라스크로 옮깁니다. 37 ° C에서 5 % CO₂ 로 3-4 일 동안 배양합니다.
      참고: 수확한 세포의 수에 따라 적절한 부피의 배지를 사용하여 10cm 페트리 접시(6웰 플레이트의 3-4웰), T25 플라스크(6웰 플레이트의 1-2웰) 또는 T75 플라스크(전체 6웰 플레이트)로 옮깁니다. T25 플라스크에는 5-6mL의 배지를, 페트리 접시에는 10-12mL의 배지를, T75 플라스크에는 12-15mL의 배지를 사용합니다. 후속 수확의 경우, 골수성 전구 세포와 대식 세포 세포가 동일한 계통/골수성 형성 복합체에서 온 경우 이전 수확물에서 풀링될 수 있습니다. 플라스크가 플라스크의 세포 수를 유지하고 공급하기에 충분한지 확인하십시오. 대식세포는 증식하지 않습니다. 이들은 대식세포 전구 세포에서 생성됩니다. 대식세포는 발현 마커를 잃지 않고 2-6주 동안 통합되고 유지될 수 있습니다.
6. 대식세포 수확
   참고: Mac-CM2 배지에서 대식세포 분화 14일이 지나면 대식세포 배양은 공동 배양 또는 유세포 분석을 위한 준비가 됩니다.
   1. 사용한 배지를 모아 50mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 플라스크/플레이트를 PBS로 헹구어 잔류 매체와 세포를 제거합니다.
   2. 플라스크에 기본 매체(T25의 경우 3mL, T75의 경우 5mL)를 추가하고 멸균 세포 스크레이퍼를 사용하여 플라스크/플레이트 바닥에서 세포를 분리합니다. 세포를 원뿔형 튜브로 옮기고 필요한 경우 스크래핑을 반복합니다.
   3. 실온에서 200 x g 에서 5분 동안 원심분리기. 상층액을 조심스럽게 제거하고 추가 사용을 위해 적절한 배지 또는 완충액에 세포를 재현탁합니다.

4. 기도세포, 내피세포, 대식세포의 공동배양

참고: 이 절차는 Costa et ^al.12에서 채택한 세포 배양 삽입물을 사용하여 기도 세포, 내피 세포 및 대식세포(그림 1A)를 공동 배양하는 단계를 설명합니다.

1. 공동 배양을 위한 세포 배양 삽입물의 ECM 코팅(공동 배양 0일차)
   1. 3.0μm 공극 폴리에스테르(PET) 세포 배양 삽입물을 4mg/mL ECM 용액으로 코팅합니다. 플레이트 내의 세포 배양 삽입물의 정점 면을 4mg/mL의 ECM 용액으로 간단히 코팅합니다. 피펫 오프 잔류 ECM 솔루션. 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 인큐베이터에 놓습니다.
   2. 큰 페트리 접시(100mm x 20mm 또는 150mm x 20mm)를 구하십시오. 깨끗한 핀셋을 사용하여 12웰 플레이트의 세포 배양 삽입물을 대형 페트리 접시로 멸균 방식으로 옮깁니다. 기저부 측면이 수직이 되도록 인서트를 반전합니다.
   3. 기저측 면을 4mg/mL ECM 용액으로 코팅합니다. 피펫 오프 잔류 ECM 솔루션. ECM으로 코팅된 세포 배양 인서트가 있는 페트리 접시를 37°C 인큐베이터에 넣고 밤새 건조시킵니다.
2. iPSC 유래 내피 세포의 해리 및 도금(공동 배양 1일차)
   1. T75 플라스크를 PBS와 흡입 용액으로 세척합니다. T75 플라스크에 트립신 유사 프로테아제 5mL를 추가하고 37°C에서 8분 동안 배양합니다. 내피 세포가 플라스크에서 들어 올려졌는지 육안으로 평가합니다.
      참고: iPSC 유래 내피 세포가 플라스크에서 들어 올려지지 않은 경우 typsin-like protease dissociation 시간을 늘립니다.
   2. 플라스크를 두드려 내피 세포를 분리하고 세포를 15mL 원뿔형으로 옮깁니다. 해리를 중지하기 위해 5mL의 정지 매체를 추가합니다. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리 셀.
   3. 상층액을 흡입하고 10μM의 ROCKi를 사용하여 1mL의 내피 배양 배지에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 세포 계수를 위해 10μL의 재현탁 용액을 얻고 계수하는 동안 세포를 얼음 위에 놓습니다.
   4. 100μL의 내피 배양 배지에 12mm 세포 배양 삽입물당 150,000개의 iPSC-내피 세포를 사용합니다. 삽입당 원하는 셀 수에 도달하도록 각 미디어 볼륨을 조정합니다.
   5. 인큐베이터에서 ECM 코팅된 3.0μm 세포 배양 인서트가 있는 페트리 접시를 얻습니다(단계 4.1-4.3 참조).
   6. iPSC-내피 세포를 재현탁하고 150,000개의 세포가 있는 100μL를 거꾸로 된 세포 배양 삽입체(기저측 면이 위를 향함)에 피펫팅합니다. 준비된 각 세포 배양 삽입물에 대해 피펫팅을 반복합니다.
   7. 세포를 조심스럽게 인큐베이터로 옮기고 3시간 동안 방해받지 않고 그대로 두십시오.
   8. 12-웰 플레이트에서 각 웰에 1mL의 내피 배양 배지를 추가합니다(준비된 각 세포 배양 삽입물 수에 대해).
   9. 인큐베이터에서 내피 세포가 있는 페트리 접시를 꺼냅니다. 깨끗한 핀셋을 사용하여 세포 배양 삽입물을 내피 배양 배지가 있는 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다(삽입물을 뒤집어 바닥이 이제 배지 쪽을 향하도록 함).
   10. 현미경으로 내피 세포가 부착되었는지 육안으로 확인합니다. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓습니다.
3. iPSC 유래 기도 오가노이드의 해리 및 도금(공동 배양 2일차)
   참고: ECM 폴리머에서 기도 오가노이드를 분리하려면 1.1.1-1.1.15단계를 참조하십시오. 트립신 유사 프로테아제 (단계 1.1.10) 해리 기간을 15-20 분으로 수정하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
   1. 15-20분 후 Stop Media 3mL를 첨가하여 트립신 유사 단백질 분해 효소 반응을 중단합니다. P1000 피펫과 원심분리기로 400 x g 에서 5분 동안 용액을 재현탁합니다.
   2. 상층액을 흡인하고 10μM의 ROCKi를 사용하여 1mL 기도 확장 배지에서 기도 오가노이드를 재현탁합니다. 혈구계 세포 계수를 위해 10μL 샘플을 채취하고 계수하는 동안 얼음 위에 세포를 놓습니다.
   3. 12mm 세포 배양 삽입물당 500μL의 기도 확장 배지에 300,000개의 iPSC-기도 세포를 시딩합니다. 준비된 삽입물당 원하는 세포 수에 도달하도록 각 매체 부피를 조정합니다.
   4. 37 °C 인큐베이터에서 내피 세포(기저측 쪽에 씨를 뿌림)가 있는 세포 배양 삽입물이 있는 플레이트를 제거합니다.
   5. iPSC-기도 세포와 300,000개의 세포가 있는 500 μL를 각 세포 배양 삽입체의 정점 챔버에 재현탁합니다. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 48시간 동안 놓고 정점 셀을 액체-액체 상태로 만듭니다.
4. Air-lifting co-culture (공동 문화 4일차)
   1. 세포 배양 삽입물의 정점 쪽에서 배지를 제거합니다. 기저측 배지를 1:1 기도 분화 배지 및 내피 배양 배지로 변경합니다. 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
5. iPSC 유래 대식세포의 해리 및 도금(공동 배양 5일차)
   1. 세포 스크레이퍼를 사용하여 플라스크에서 iPSC 유래 대식세포를 해리합니다(3.22-3.24단계 참조). 300 x g 에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 흡입합니다.
   2. Mac-CM2 1mL에 iPSC-대식세포를 재현탁합니다. 세포 계수를 위해 10μL 샘플을 채취하고 계수하는 동안 얼음 위에 세포를 놓습니다. 대식세포의 수는 파종된 기도 세포의 수(대식세포와 기도세포의 1:1 비율)를 반영합니다.
   3. 세포 계수 후, 준비된 세포 배양 웰당 35μL 배지에서 300,000개의 대식세포를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 분취합니다. 200 x g 에서 5분 동안 원심분리기
   4. 원심분리 후 상층액을 피펫으로 빼냅니다. 각 Mac-CM2의 대식세포를 계산에서 다시 중단합니다.
   5. 인큐베이터에서 내피 세포와 기도 세포의 공동 배양이 있는 삽입물을 제거합니다. 35μL의 Mac-CM2에 300,000개의 대식세포를 세포 배양 삽입체의 정점 쪽에 파종합니다. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 48시간 동안 놓습니다.
      참고: 세포 배양 삽입물에 대한 iPSC 면역 세포의 부착을 확인하기 위해 형광 프로브로 세포를 태그할 수 있습니다. 현미경을 통해 형광 신호에 대한 준수 여부를 확인합니다.대식세포 도금 후 48시간.
6. 트리플 공동 배양 (공동 배양 7일차)
   1. 공동 배양이 감염 연구, 경상피 전기 저항(TEER) 측정 및 장벽 무결성 분석과 같은 다운스트림 응용 분야에 사용할 준비가 되었는지 확인합니다.

결과

iPSC 유래 기도 오가노이드, 내피 세포, 면역 세포 및 공동 배양의 분화가 성공적으로 완료된 것으로 평가할 수 있는 여러 단계가 있습니다. 차별화는 서로 다른 iPSC 라인에서 수행될 수 있으며, 이 프로토콜은 최소 5개의 서로 다른 라인에서 테스트되었습니다. 프로토콜은 모든 새로운 iPSC 라인에 맞게 조정되어야 하며, 특히 시딩 밀도를 수정하고 최적화해야 합니다.

토론

바이러스 감염 및 기타 독소를 연구하기 위해 대기도의 혈액-공기 장벽 모델을 개발하고 구현하려면 관련된 다양한 세포 유형의 성공적인 분화와 기능을 보장하기 위해 세부 사항에 대한 세심한 주의가 필요합니다. 이 논의에서는 성공적인 차별화를 위한 핵심 요소, 잠재적 과제, 대체 응용 프로그램 및 인간 질병 연구에 대한 시사점을 다룹니다.

성...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well plates	Corning	3512
12-well inserts, 0.4 µm, translucent	VWR	10769-208
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Accutase	Innovative Cell Tech	AT104
Activin A	R&D Systems	338-AC
All-trans retinoic acid (RA)	Sigma-Aldrich	R2625
ascorbic acid	Sigma	A4544
B27 without retinoic acid	ThermoFisher	12587010
BMP4	R&D Systems	314-BP/CF
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution	Gibco	15260-037
Br-cAMP	Sigma-Aldrich	B5386
CD 14 (FITC)	BioLegend	982502
CD 31 PECAM-1(APC)	R&D System	FAB3567A
CD 45 (PE)	BD Biosciences	560975
CD 68 (PE)	BioLegend	33808
CHIR99021	Abcam	ab120890
CPM	Fujifilm	014-27501
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Dispase	StemCellTech	7913
DMEM/F12	Gibco	10565042
Dorsomorphin	R&D Systems	3093
E-CAD/CD 324 (APC)	BioLegend	324107
EGF	R&D Systems	236-EG
EGM2 Medium	Lonza	CC-3162
EPCAM/CD 326 (APC)	BioLegend	324212
FBS	Gibco	10082139
FGF10	R&D Systems	345-FG/CF
FGF7	R&D Systems	251-KG/CF
Fibronectin	Fisher	356008
Forskolin	Abcam	ab120058
Glutamax	Life Technologies	35050061
Ham’s F12	Invitrogen	11765-054
HEPES	Gibco	15630-080
IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine)	Sigma-Aldrich	I5879
IL-3	Peprotech	200-03
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax	Invitrogen	31980030
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828028
Matrigel	Corning	354230
M-CSF	Peprotech	300-25
Monothioglycerol	Sigma	M6145
mTeSR plus Kit (10/case)	Stem Cell Tech	5825
N2	ThermoFisher	17502048
NEAA	Life Technologies	11140050
PBS	Gibco	10010023
Pen/strep	Lonza	17-602F
ReleSR	Stem Cell Tech	5872
RPMI1640 + Glutamax	Life Technologies	12633012
SB431542	R&D Systems	1614
SCF	PeproTech	300-07
SMA	Invitrogen	50-9760-80
STEMdiff APEL 2 Medium	STEMCELL Technologies	5275
TrypLE Express	Gibco	12605-028
VEGF165	Preprotech	100-20
Vimentin	Cell Signaling	5741S
Y-27632 (Rock Inhibitor)	R&D Systems	1254/1
ZO-1	Invitrogen	339100