迷路切除術中の生理学的条件下での前庭末端器官の収穫

要約

ここでは、迷路切除術中に生理学的条件下でヒトの前庭末端器官を採取する技術と、免疫染色を用いたそれらの解析について述べる。

要約

生きている人間の内耳は、生体組織へのアクセスを制限する高密度の耳嚢骨に包まれているため、研究が困難です。従来の側頭骨組織病理学法は、9〜10か月かかり、RNA分解による組織分析の種類を減らす、長くて高価な脱灰プロトコルに依存しています。メニエール病などの耳鼻咽喉科疾患を細胞および分子レベルでより深く理解するために、新鮮なヒト内耳組織にアクセスする方法を開発することが急務です。この論文では、生理学的条件下で生体ドナーからヒト前庭末端器官を採取する技術について説明します。メニエール病と鼓室内ゲンタマイシン注射に抵抗性の「落下発作」を患った個人は、迷路切除術を受けました。伝統的な乳房切除術が最初に実施され、水平および上半規管 (SCC) が特定されました。乳様突起腔は、細胞の完全性を維持するために、より生理学的条件下で迷路を開くことができるように、バランスの取れた塩溶液で満たされました。 レンズクリーニングシース灌漑システムを備えたゼロ度内視鏡を使用して、水中の乳様突起空洞を視覚化し、2 mmのダイヤモンドバリを使用して、水平および優れたSCCをスケルトン化して開き、続いて前庭を開かしました。上側および側方SCCの膨大部と管管の一部を採取した。卵形嚢も同様に収穫されました。採取した組織を直ちに氷冷緩衝液に入れ、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の4%パラホルムアルデヒドに1時間固定しました。組織を1x PBSで数回すすぎ、4°Cで48時間保存しました。 組織サンプルは、テネイシン-C(Calyx)、オンコモジュリン(Stralelar Hair cells)、カルレチニン(CalyxおよびType II有毛細胞)、シナプス小胞タンパク質2(遠心性繊維およびブートン)、β-tubulin 1(Calyxおよび求心性ブートン)に対する一次抗体の組み合わせによる免疫染色を行い、続いて蛍光色素標識二次抗体とインキュベートしました。その後、組織サンプルをすすぎ、共焦点顕微鏡検査のためにマウントしました。画像は、膨大部と黄斑の有毛細胞と神経構造の存在を明らかにしました。このプロトコルは、生体ドナーから無傷で高品質のヒト内耳組織を採取することが可能であり、耳科疾患の研究に重要なツールを提供する可能性があることを実証しています。

概要

生きている人間の内耳は、側頭骨の密集した耳包骨内にあるため、研究が困難です。その結果、ヒトの内部組織へのアクセスは制限されており、研究者は主に死後の組織採取に依存してきました。死後側頭骨組織病理学(TBH)は、100^{年以上にわたり、}ヒトの耳科疾患を理解するための重要なツールでした^1,2,3。TBHの組織は、側頭骨の死後採取、長い(9〜10か月)脱灰および組織調製プロセス、続いてヘマトキシリンおよびエオシン染色によって調製されます。TBHは、健康で病気にかかったヒトの内耳に関する新しい情報を明らかにするための重要なツールであり続けますが、長い死後時間や長く過酷な組織処理方法により、特定の目的に対するその有用性が制限され、ヒトの内耳組織を研究するための補助的な方法が必要になります。高解像度の磁気共鳴画像法は、内耳器官を視覚化できますが、細胞または分子レベルで構造を見るのに十分な解像度が不足しています^4,5。これらの課題により、多くのヒト内耳疾患は依然として十分に理解されていません。

別のアプローチは、手術中に内耳組織を採取することです。迷路切除術または経迷路前庭神経鞘腫切除術では、内耳組織は意図的に犠牲にされます。経迷路前庭神経鞘腫切除中に患者から採取された卵形嚢は、前庭有毛細胞の形態を特徴付けるために使用されてきました^6,7,8および有毛細胞の再生^9,10を研究しています。最近では、臓器提供者から内耳器官を採取する技術が開発されており、これは、組織外傷を最小限に抑えながら、広げられた楕円形の窓を通じて卵形膜や他の前庭末端器官を取り除くために使用できるトランスカナルアプローチを使用しています^11,12。この技術を使用して、ヒト卵管¹³のシングルセルトランスクリプトームプロファイルを特徴付けることが可能になりました。しかし、これらの技術は、収穫時に内耳器官を非生理学的条件にさらします。具体的には、内耳器官は、外リンパ液の不在にさらされ、通常の生理食塩水ドリル灌漑で水没する可能性があります。これは、外リンパ液とは実質的に異なるイオン組成を持っています。さらに、脱水した膜状の迷路は、手術用顕微鏡を最大倍率にしても視覚化が困難であり、非外傷性外科的解剖を困難にします。機械的外傷は組織をさらに損傷する可能性があり、私たちの逸話的な経験は、外科的組織が機械的損傷と細胞変性のために免疫染色の質が不十分であることが多いことを示唆しています。生物学的研究のために、ヒトの内耳組織を非外傷的に採取する新しい技術が必要であり、それは十分に理解されていないヒトの内耳疾患を解明する可能性があります。ここでは、迷路切除術中にヒトの前庭末端器官をより生理学的条件下で採取するための水中技術と、免疫染色を用いたそれらの分析について説明します。

プロトコル

このプロトコルは、ジョンズ・ホプキンス大学医学部(IRB00203441)の治験審査委員会(IRB)の承認を得て、ヒト組織および感染性の可能性のある物質の使用に関する機関の方針に従って開発されました。組織採取は、転倒発作を伴う難治性メニエール病の標準的な臨床治療の一部である迷路切除術中に行われました。

1.迷路切除術と組織採取

1. このプロトコルを利用する前に、地域の治験審査委員会(IRB)の承認を取得し、ヒトおよび感染性物質の使用に関する施設の方針を審査し、組織提供の同意を得てください。外科的迷路切除術または内耳道への経迷路アプローチ中に組織採取を行いますが、これは標準的な臨床ケアの一部です。
2. 患者を準備します。
   1. 麻酔の導入前に、顔面神経を監視できるように、長時間作用型麻痺の回避について麻酔チームと話し合ってください。
   2. 全身麻酔が導入されたら、患者を挿管し、手術台を180°回転させます。顔面神経モニタリング電極を配置し、術前の抗生物質予防が投与されていることを確認します。
   3. 1%リドカインと1:100,000エピネフリンを外耳道と耳介後領域に注射します。.ベタジンを使用して標準的な方法で耳を準備します。
3. #15ブレードを使用して、耳介後ひだの1cm後方に標準(5〜6 cm)の耳介後曲線切開を作成します。
4. 耳介後軟部組織を持ち上げます。.
   1. 側頭筋膜を上向きに特定し、耳介後皮膚フラップを耳道に向かって前方に持ち上げます。
   2. 標準的な 7 形の骨膜切開を作成し、ヘンレの背骨と骨の外耳道が特定されるまで骨膜を前方に持ち上げます。セルフリトレーニングリトラクターを配置します。
5. 乳様突起切除術を行います。
   1. 完全な乳様突起切除術を行い、テグメンを上方に、S状結腸洞を後方に特定し、外耳道を前方に薄くします。
   2. 水平半規管とインカスの短いプロセスを特定します。
      注:乳様突起は、水中組織収集用の液体を保持できる容器であり続けるために受け止めないでください。
6. 半規管(SC)を特定します。
   1. 手術用顕微鏡(倍率2〜4倍)で、3 mmの粗いダイヤモンドバリを使用して、上SCの外側の迷路周囲空気細胞、亜円弧状空気細胞、および後SCの後ろの逆迷路空気細胞を除去し、一般的なCRUに上方に伸びます。
7. 迷路を沈めてください。
   1. 乳様突起腔を平衡塩溶液(BSS)に浸し、レンズクリーニングシース灌漑システムを備えたゼロ度内視鏡を使用して迷路を視覚化します。
   2. レンズクリーニングシース灌漑システムを使用して、BSSで乳様突起腔を洗浄し、血液を洗い流し、迷路の視覚化を改善します。
8. ブルーラインのSC。
   1. 乳様突起腔内のBSSを適切なレベルに保ちながら、内視鏡を使用して視覚化しながら、3mmのダイヤモンドバリを使用して、内視鏡で見たときに半規管が青みがかった線として現れるまで、耳嚢骨を慎重にドリルで削り取ることにより、3つの半規管すべてを「ブルーライン」にします。
   2. 図1に示すように、灌漑システムを使用してBSS溶液で断続的に灌漑し、血液を洗い流し、適切な視覚化を実現します。
9. SCアンプラを収穫します。
   1. BSSの下で、外側半規管のドームに入り、その膨大部が特定されるまでこれを前方にたどります。上皮内SCに入り、これを内側にその膨大部に向かってたどり、上皮の膨大部で採取することができます。
   2. ローゼン針を使用して、水平で上側のSC膨大部をクリスタから持ち上げ、求心性線維を上皮と膜性迷路から分離します。.次に、これらの構造を削除します。
   3. 後部SCのドームを横断し、これをその膨大部に対して下および前方にたどります。同様に、後部のSC膨大部を採取し、BSS内のすべての組織を氷上に置きます。
10. 黄斑を収穫します。
    1. 水平および後部のSC膨大部の間の骨を取り除き、前庭を露出させます。卵形嚢の膜壁は、膨大部の除去によって引き裂かれます。液面が維持されている限り、黄斑は前方に付着したままになります。それを持ち上げて取り外します。
    2. 球形のくぼみには球形のくぼみがあります。急激に持ち上げて、くぼみから取り外します。同様に、組織サンプルを氷上のBSSに入れます。
11. 採取後1時間以内に、氷上の組織サンプルを手術室から実験室に輸送し、固定します。

2. 免疫組織化学およびイメージング

1. サンプルを修正します。
   1. 組織サンプルを4%パラホルムアルデヒド(PFA)に1xリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)に入れ、室温(RT)で1時間穏やかに揺さぶるか、軌道振とう(100rpm)します。
      注:4%PFA溶液(合計5mL):625mLの32%PFAストック溶液+ 500mLの10xPBS+3875mLのddH₂O。
2. 組織サンプルを1x PBS溶液に移し、RTで15分(または必要に応じてそれ以上)3回すすぎ、穏やかに揺さぶるか眼窩振とうします。
3. RTの1x PBSで解剖顕微鏡下で余分な結合組織を除去します。
4. サンプルを脱灰します。
   1. 組織サンプルを1x PBS溶液中の5%エチレンジアミン四酢酸(EDTA)に移し、微細な骨破片と耳円錐形から感覚上皮を取り除きます。室温で15〜30分間インキュベーションを行い、穏やかに揺さぶるか、軌道を振る。
5. 再度、組織サンプルを1x PBS溶液に移し、RTで15分(または必要に応じてそれ以上)3回すすぎ、穏やかに揺さぶるか軌道振とうします。
6. 125-200 mLの2x ブロッキングバッファー(2x BB)を各サンプルに適用し、室温で1.5-5時間、または4°Cで一晩(ON)インキュベートします。 インキュベーションを一定の軌道振とう下で実行します。
   注:2x ブロッキングバッファー(2x BB):0.5% Triton X-100を添加した1x PBSの最大5 mLに溶解した1 gのウシ血清アルブミン(BSA)1 g。BSAは、非特異的抗原結合部位のブロッキング剤として機能します。
7. 一次抗体を使用して染色します。
   1. 1x BBに溶解した一次抗体の組み合わせ120〜150 mLを希望の希釈液まで適用します。ウサギ抗テネイシン-C抗体を1:200希釈(2.5 μg/mL)、ヤギ抗オンコモジュリン抗体を1:200希釈(2.5 μg/mL)、マウス抗カルレチニンを1:300希釈(2.2 μg/mL)、DAPIを1:1000希釈(1 μg/mL)で適用します。次に、サンプル(蓋付き)を4°C(冷蔵庫または冷蔵室)に移し、ONインキュベーションのために穏やかな軌道振とうを行います。
      注:1x BB:2x BBと1x PBSを等量混合し、0.5% Triton X-100を添加します。
8. 組織サンプルを1x PBS溶液で、15分×3回(または必要に応じてそれ以上)RTで穏やかに揺さぶりながらすすぎます。
9. 二次抗体を用いて染色します。
   1. 1:2000希釈(1 μg/mL)で1x BBに溶解した蛍光色素標識二次抗体の組み合わせを120〜150 mL適用します。488 nm標識抗ウサギ二次抗体、568 nm抗マウス二次抗体、および647 nm抗ヤギ二次抗体を適用します。
   2. 次に、サンプル(蓋付き)をRTで1.5〜2時間(または4°CでON)の穏やかな軌道振とうの下でインキュベートします。
10. 組織サンプルを1x PBS溶液で、15分×3回(または必要に応じてそれ以上)RTで穏やかに揺さぶりながらすすぎます。
11. 顕微解剖と埋込みを行います。
    1. 解剖顕微鏡下で、感覚前庭上皮の周りから余分な組織と膜を取り除きます。70%エタノールを使用してガラス組織型スライドの表面を洗浄し、風乾させて、適切な封入剤を55 mL滴下します。
    2. 感覚組織サンプルを封入剤に移します。細い鉗子を使用して、毛束を上にしてサンプルを封入剤の向きを穏やかに合わせます。
    3. サンプルが入った封入剤の上に適切なサイズのカバーガラスを静かに置き、気泡を抑えます。カバーガラスが共焦点顕微鏡に必要な#1.5の厚さグレードであることを確認してください。
    4. スライドを暗い場所(ベンチ引き出しなど)に置き、取り付け媒体をセットします。透明なマニキュアを使用してカバーガラスをスライドに密封し、暗い場所で乾かしてから、共焦点顕微鏡で観察します。その後、密封されたスライドを暗所(スライドフォルダーのスライドボックス)にイメージングするまで4°で保管します。
12. 488 nmおよび657 nmチャネルの倍率40倍〜100倍の共焦点顕微鏡を使用して、試料をイメージングします。

結果

この技術を使用して、ヒトの卵形嚢と外側および上管の膨大部を無傷で採取し、外傷を最小限に抑えました(図2)。図2に見られるように、膨大部は膜管のかなりの部分で採取できます。抗テネイシン-C(細胞外マトリックスタンパク質)および抗オンコモジュリン(パルブアルブミンタンパク質ファミリーの低分子カルシウム結...

ディスカッション

この論文では、内視鏡を使用してBSSの前庭末端器官を水中で採取するための新しい技術と、免疫蛍光イメージングを使用したそれらの分析について説明します。ここでは、無傷の前庭有毛細胞と免疫標識を成功させるための十分な組織品質を持つ無傷の前庭末端器官の収穫を実証します。我々の標本中の有毛細胞密度は、生きた臓器提供者から得られた他の研究で得...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Phosphate Buffered Saline Stock	Sigma-Aldrich	P5493
32% Paraformaldehyde Stock Solution	ThermoFisher Scientific	50-980-495
Alexa Fluor 488 Anti-Rabbit Secondary Antibody	Jackson Immunoresearch	111545144
Alexa Fluor 568 Anti-Mouse Secondary Antibody	Jackson Immunoresearch	115575146
Alexa Fluor 647 Anti-Goat Secondary Antibody	Jackson Immunoresearch	705607003
Balanced Salt Solution	ThermoFisher Scientific	14040117
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	10711454001
Confocal microscope	Nikon A1	A1
Cover glass (18 mm x 18 mm, thickness #1.5 )	Corning	2850-18
Endo-Scrub 2 Lens Cleaning Sheath	Medtronic	IPCES2SYSKIT
Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) Acid Solution	Sigma-Aldrich	E8008
Goat Anti-oncomodulin Antibody	R&D Systems	AF6345
Hopkins 0 Degree Telescope	Karl Storz
Mouse Anti-calretinin Antibody	BD Biosciences	610908
ProLong Gold antifade reagent	Invitrogen	P10144
Rabbit Anti-tenascin C Antibody	Millipore	AB19013
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5