Забор вестибулярных конечных органов в физиологических условиях при лабиринтезии

Резюме

Here, we describe a technique for harvesting human vestibular end-organs under physiologic conditions during labyrinthectomy and their analysis using immunostaining.

Аннотация

Живое внутреннее ухо человека сложно изучить, потому что оно заключено в плотную глазную капсульную кость, которая ограничивает доступ к биологической ткани. Традиционные методы гистопатологии височной кости основаны на длительных и дорогостоящих протоколах декальцинации, которые занимают 9-10 месяцев и сокращают количество видов анализа тканей, возможных из-за деградации РНК. Существует острая необходимость в разработке методов доступа к свежим тканям внутреннего уха человека, чтобы лучше понять отологические заболевания, такие как болезнь Меньера, на клеточном и молекулярном уровне. В данной статье описана методика забора вестибулярных конечных органов человека у живого донора в физиологических условиях. Пациенту с болезнью Меньера и «приступами падений», которые были рефрактерны к внутритимпанальной инъекции гентамицина, была выполнена лабиринтэктомия. Сначала была выполнена традиционная мастоидэктомия, в ходе которой были определены горизонтальные и верхние полукружные каналы (ПКК). Сосцевидная полость была заполнена сбалансированным солевым раствором, чтобы лабиринт мог быть открыт в более физиологических условиях для сохранения клеточной целостности. Для визуализации погруженной сосцевидной полости использовали эндоскоп нулевого градуса с системой орошения оболочки для очистки линз, а для скелетирования и вскрытия горизонтального и верхнего ПКК с последующим преддверием был использован алмазный жернов толщиной 2 мм. Были собраны ампулы и часть протоков канала для верхнего и бокового ПКК. Утрикулу собирали аналогичным образом. Собранную ткань немедленно помещали в ледяной буфер, а затем фиксировали в течение одного часа в 4% параформальдегиде в фосфатно-солевом буфере (PBS). Салфетку несколько раз промывали в 1x PBS и хранили в течение 48 ч при 4 °C. Образцы тканей подвергали иммуноокрашиванию комбинацией первичных антител против тенасцина-С (Calyx), онкомодулина (стреолярные волосковые клетки), кальретинина (Calyx и волосковые клетки II типа), синаптического везикулярного белка 2 (эфферентные волокна и бутоны), β-тубулина 1 (Calyx и афферентные бутоны) с последующей инкубацией с флуорофор-конъюгированными вторичными антителами. Затем образцы тканей промывали и устанавливали для конфокального микроскопического исследования. Изображения показали наличие ампулярных и макулярных волосковых клеток и нервных структур. Этот протокол демонстрирует, что можно получить неповрежденную, высококачественную ткань внутреннего уха человека от живых доноров и может стать важным инструментом для изучения отологических заболеваний.

Введение

Живое внутреннее ухо человека сложно изучить из-за его расположения в плотной глазной капсуле височной кости. Следовательно, доступ к внутренним тканям человека был ограничен, и исследователи в основном полагались на посмертный забор тканей. Посмертная гистопатология височной кости (ТГК) уже более 100 лет является важнейшим инструментом для понимания отологических заболеваний человека ^1,2,3. Ткань для ТГБ подготавливается путем посмертного забора височной кости, длительного (9-10 месяцев) процесса декальцинации и подготовки тканей с последующим окрашиванием гематоксилином и эозином. В то время как TBH останется важным инструментом для получения новой информации о здоровом и больном внутреннем ухе человека, длительное время вскрытия и длительные и жесткие методы обработки тканей ограничивают его полезность для определенных целей, что требует дополнительных методов изучения тканей внутреннего уха человека. Магнитно-резонансная томография с высоким разрешением позволяет визуализировать органы внутреннего уха, но не обладает достаточным разрешением для просмотра структур на клеточном или молекулярном уровне ^4,5. Из-за этих проблем многие заболевания внутреннего уха человека остаются малоизученными.

Альтернативным подходом является забор тканей внутреннего уха во время операции. Во время лабиринтэктомии или транслабиринтной вестибулярной резекции шваннома ткани внутреннего уха намеренно приносятся в жертву. Утрикулы, собранные у пациентов во время транслабиринтной вестибулярной резекции шванномы, были использованы для характеристики морфологии вестибулярных волосковых клеток ^6,7,8 и изучения регенерации волосковых клеток ^9,10. В последнее время были разработаны методы забора органов внутреннего уха у доноров органов с использованием трансканального подхода, который может быть использован для удаления утрикулы и, возможно, других вестибулярных конечных органов через расширенное овальное окно с минимальной травматизацией тканей^11,12. Используя эту методику, стало возможным охарактеризовать транскриптомные профили одиночных клеток для человеческого утрикулы¹³. Тем не менее, эти методы подвергают органы внутреннего уха воздействию нефизиологических условий во время сбора урожая. В частности, органы внутреннего уха могут подвергаться отсутствию перилимфатической жидкости и погружению в воду при обычном орошении солевым раствором, который имеет ионный состав, существенно отличающийся от перилимфатической жидкости. Кроме того, обезвоженный мембранный лабиринт трудно визуализировать, даже при максимальном увеличении операционного микроскопа, что затрудняет атравматичное хирургическое рассечение. Механическая травма может еще больше повредить ткани, и наш анекдотический опыт показывает, что хирургическая ткань часто имеет недостаточное качество иммуноокрашивания из-за механического повреждения и клеточной дегенерации. Существует потребность в новых методах атравматичного забора тканей внутреннего уха человека для биологических исследований, которые могут пролить свет на плохо изученные заболевания внутреннего уха человека. Здесь мы опишем подводную технику забора вестибулярных конечных органов человека в более физиологических условиях во время лабиринтэктомии и их анализ с помощью иммуноокрашивания.

протокол

Этот протокол был разработан с одобрения институционального наблюдательного совета (IRB) Медицинской школы Университета Джонса Хопкинса (IRB00203441) и в соответствии с институциональной политикой использования человеческих тканей и потенциально инфекционного материала. Забор тканей проводился во время лабиринтэктомии, которая является частью стандартной клинической помощи при стойкой болезни Меньера с приступами падения.

1. Лабиринтэктомия и забор тканей

1. Получите одобрение местного институционального наблюдательного совета (IRB), ознакомьтесь с политикой учреждения в отношении использования человеческого и инфекционного материала, а также получите согласие на донорство тканей перед использованием этого протокола. Выполняйте забор тканей во время хирургической лабиринтэктомии или транслабиринтного доступа к внутреннему слуховому проходу, что является частью стандартной клинической помощи.
2. Подготовьте пациента.
   1. Перед введением анестезии обсудите с анестезиологической бригадой, как избежать паралича длительного действия, чтобы можно было контролировать лицевой нерв.
   2. После введения общей анестезии интубируйте пациента и поверните операционный стол на 180°. Установите электроды для мониторинга лицевого нерва и убедитесь, что проводится предоперационная антибиотикопрофилактика.
   3. Введите 1% лидокаин с соотношением 1:100 000 адреналина в наружный слуховой проход и постоушную область. Подготовьте ухо стандартным образом с помощью бетадина.
3. Используйте лезвие #15 для создания стандартного (5-6 см) постаурикулярного криволинейного разреза на 1 см позади заушной складки.
4. Подтяните мягкие ткани постоушной раковины.
   1. Определите височную фасцию сверху и поднимите постоушный кожный лоскут спереди по направлению к ушному каналу.
   2. Сделайте стандартный 7-образный надкостничный разрез и приподнимайте надкостницу спереди до тех пор, пока не будут идентифицированы позвоночник Генле и костный слуховой проход. Разместите самообучающиеся втягивающие устройства.
5. Провести мастоидэктомию.
   1. Выполнить полную мастоидэктомию, определив тегмен сверху, сигмовидный синус сзади и истончив наружный слуховой проход спереди.
   2. Определите горизонтальный полукружный канал и короткий отросток инкуса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сосцевидный отросток не должен быть тарелкой, чтобы он оставался сосудом, способным удерживать жидкость для подводного сбора тканей.
6. Определите полукружные каналы (СК).
   1. Под операционным микроскопом (2-4-кратное увеличение) с помощью крупнозернистого алмазного заусенца толщиной 3 мм удалите перилабиринтные воздушные ячейки, боковые по отношению к верхнему СК, субдуарные воздушные ячейки и ретролабиринтные воздушные ячейки за задним СК, простирающиеся вверх к обыкновенной голени.
7. Погрузите лабиринт.
   1. Погрузите сосцевидную полость в сбалансированный раствор соли (БСС) и визуализируйте лабиринт с помощью эндоскопа нулевого градуса с системой орошения оболочки для очистки линз.
   2. Используйте систему орошения оболочки хрусталика для орошения сосцевидной полости с помощью BSS, смывая кровь и обеспечивая улучшенную визуализацию лабиринта.
8. Синяя линия КА.
   1. Поддерживая достаточный уровень BSS в сосцевидной полости и используя эндоскоп для визуализации, используйте алмазный заусенец диаметром 3 мм для «синей линии» всех трех полукружных каналов, осторожно просверливая кость глазной капсулы до тех пор, пока полукружный канал не станет выглядеть как голубоватая линия при просмотре эндоскопом.
   2. Периодически орошайте раствором BSS, используя ирригационную систему для смывания крови и достижения адекватной визуализации, как показано на рисунке 1.
9. Сбор урожая SC ampullae.
   1. Под BSS войдите в купол бокового полукружного канала и следуйте по нему спереди до тех пор, пока не будут идентифицированы его ампулы. Войдите в верхнюю СК и следуйте по ней медиально к ампулам, которые могут быть собраны с ампулами верхней СК. Резко разрежьте боковой проток СК для облегчения удаления.
   2. С помощью иглы Розена поднимите горизонтальные и верхние ампулы SC от кристы и отделите афферентные волокна от эпителия и перепончатого лабиринта. Затем удалите эти конструкции.
   3. Пересеките купол задней СК и следуйте по нему ниже и спереди от его ампул. Аналогичным образом соберите задние ампулы SC и поместите всю ткань в BSS на лед.
10. Соберите урожай макулы.
    1. Удалите кость между горизонтальной и задней ампулами СК, чтобы обнажить преддверие. Перепончатые стенки утрикулы будут разорваны при удалении ампул. До тех пор, пока поддерживается уровень жидкости, макулы будут оставаться прикрепленными спереди; Поднимите и снимите его.
    2. Мешочек находится внутри сферического углубления; Резко приподнимите и удалите его из углубления. Аналогичным образом поместите образцы тканей в BSS на лед.
11. Транспортировка образцов тканей на льду из операционной в лабораторию для фиксации в течение 1 ч после забора.

2. Иммуногистохимия и визуализация

1. Исправьте образец.
   1. Поместите образец ткани в 4% параформальдегид (PFA) в 1x фосфатно-солевой буфер (1x PBS) при комнатной температуре (RT) с легким покачиванием или встряхиванием орбиты (100 об/мин) в течение 1 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 4% раствор PFA (всего 5 мл): 625 мл 32% стокового раствора PFA + 500 мл 10xPBS + 3875 мл ddH₂O.
2. Перенесите образцы тканей в 1x раствор PBS и промойте 3x 15 мин (или дольше, если это необходимо) в RT с легким покачиванием или орбитальным встряхиванием.
3. Удалите излишки соединительной ткани под препарирующим микроскопом в режиме 1x PBS при ЛТ.
4. Очистите образец от накипи.
   1. Перенесите образцы тканей в 5% этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) в 1x раствор PBS для очистки сенсорного эпителия от мелких костных остатков и отоконии. Проводить инкубацию в течение 15-30 мин при RT, с легким покачиванием или орбитальным встряхиванием.
5. Снова перенесите образцы тканей в 1x раствор PBS и промойте 3x 15 мин (или дольше, если это необходимо) в RT с легким покачиванием или орбитальным встряхиванием.
6. Нанесите 125-200 мл 2x блокирующего буфера (2x BB) на каждый образец и инкубируйте в течение 1,5-5 ч при RT или в течение ночи (ON) при 4 °C. Запускайте инкубацию при постоянном встряхивании орбиты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 2x Блокирующий буфер (2x BB): 1 г бычьего сывороточного альбумина (BSA), растворенного в 5 мл 1x PBS с добавлением 0,5% Triton X-100. BSA служит блокирующим агентом для неспецифических сайтов связывания антигенов.
7. Окрашивание с помощью первичных антител.
   1. Внесите 120-150 мл комбинации первичных антител, растворенных в 1х ВВ, до нужного разведения. Применяйте антитела к тенасцину-С у кроликов в разведении 1:200 (2,5 мкг/мл), антитела к онкомодулину коз в разведении 1:200 (2,5 мкг/мл), мышиный антикальретинин в разведении 1:300 (2,2 мкг/мл) и DAPI в разведении 1:1000 (1 мкг/мл). Затем перенесите образец (в закрытом виде) при температуре 4 °C (холодильник или холодильная камера) под легкое встряхивание орбиты для инкубации ON.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1x BB: Смешайте равный объем 2x BB и 1x PBS с добавлением 0,5% Triton X-100.
8. Промойте образцы тканей в 1x растворе PBS, 3x 15 мин (или дольше, если это необходимо), в режиме RT с легким покачиванием.
9. Окрашивание с помощью вторичного антитела.
   1. Внесите 120-150 мл комбинации флуорконъюгированных вторичных антител, растворенных в 1x BB в разведении 1:2000 (1 мкг/мл). Применяют конъюгированное вторичное антитело против кролика с длиной волны 488 нм, вторичное антитело против мыши с длиной волны 568 нм и вторичное антитело против козы длиной волны 647 нм.
   2. Затем инкубируйте образец (в закрытом виде) при ОТ под легким орбитальным встряхиванием в течение 1,5-2 ч (или ON при 4 °C).
10. Промойте образцы тканей в 1x растворе PBS, 3x 15 мин (или дольше, если это необходимо), в режиме RT с легким покачиванием.
11. Выполните микродиссекцию и монтаж.
    1. Под препарирующим микроскопом удалите излишки тканей и оболочек вокруг сенсорного вестибулярного эпителия. Используйте 70% этанол для очистки поверхности стекла гистологического предметного стекла, высушите на воздухе и нанесите каплю 55 мл соответствующей монтажной среды.
    2. Перенесите образцы сенсорной ткани в монтажную среду. С помощью тонких щипцов аккуратно сориентируйте образцы пучком волос вверх в монтажной среде.
    3. Аккуратно положите покровное стекло соответствующего размера на монтажную среду, содержащую образцы, стараясь ограничить количество пузырьков воздуха. Убедитесь, что покровное стекло имеет класс толщины #1,5, необходимый для конфокальной микроскопии.
    4. Поместите горки в темное место (например, в ящик скамейки), чтобы закрепился монтажный материал. Приклейте покровное стекло к предметному стеклу прозрачным лаком для ногтей и дайте ему высохнуть в темном месте, прежде чем рассматривать его с помощью конфокального микроскопа. После этого храните запечатанные слайды в темноте (в коробке слайдов или папке для слайдов) при температуре 4° до момента создания изображения.
12. Для получения изображения образца используйте конфокальный микроскоп с увеличением 40x-100x и каналами 488 нм и длиной волны 657 нм.

Результаты

Using this technique the human utricle and lateral and superior canal ampullae were harvested intact with minimal trauma (Figure 2). As can be seen in Figure 2, the ampullae can be harvested with a substantial portion of the membranous duct. Immunofluorescent labeling with anti-tenascin-C (extracellular matrix protein) and anti-oncomodulin (small calcium-binding protein of the parvalbumin protein family) showed intact type 1 vestibular hair cells (

Обсуждение

This paper describes a new technique for the underwater harvesting of vestibular end organs in BSS using endoscopes and their analysis using immunofluorescent imaging. Here, we demonstrate the harvest of intact vestibular end-organs with intact vestibular hair cells and sufficient tissue quality for successful immunolabeling. The hair cell density in our specimen was similar to those obtained in other studies from live organ donors¹³. To our knowledge, this is the first report of an underwater tec...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Phosphate Buffered Saline Stock	Sigma-Aldrich	P5493
32% Paraformaldehyde Stock Solution	ThermoFisher Scientific	50-980-495
Alexa Fluor 488 Anti-Rabbit Secondary Antibody	Jackson Immunoresearch	111545144
Alexa Fluor 568 Anti-Mouse Secondary Antibody	Jackson Immunoresearch	115575146
Alexa Fluor 647 Anti-Goat Secondary Antibody	Jackson Immunoresearch	705607003
Balanced Salt Solution	ThermoFisher Scientific	14040117
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	10711454001
Confocal microscope	Nikon A1	A1
Cover glass (18 mm x 18 mm, thickness #1.5 )	Corning	2850-18
Endo-Scrub 2 Lens Cleaning Sheath	Medtronic	IPCES2SYSKIT
Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) Acid Solution	Sigma-Aldrich	E8008
Goat Anti-oncomodulin Antibody	R&D Systems	AF6345
Hopkins 0 Degree Telescope	Karl Storz
Mouse Anti-calretinin Antibody	BD Biosciences	610908
ProLong Gold antifade reagent	Invitrogen	P10144
Rabbit Anti-tenascin C Antibody	Millipore	AB19013
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5