Prélèvement des organes vestibulaires terminaux dans des conditions physiologiques lors d’une labyrinthectomie

Résumé

Ici, nous décrivons une technique de prélèvement d’organes vestibulaires humains dans des conditions physiologiques lors d’une labyrinthectomie et leur analyse à l’aide de l’immunomarquage.

Résumé

L’oreille interne humaine vivante est difficile à étudier car elle est enfermée dans un os dense de la capsule otique qui limite l’accès aux tissus biologiques. Les méthodes traditionnelles d’histopathologie de l’os temporal reposent sur des protocoles de décalcification longs et coûteux qui prennent 9 à 10 mois et réduisent les types d’analyse tissulaire possibles en raison de la dégradation de l’ARN. Il est essentiel de développer des méthodes pour accéder à des tissus frais de l’oreille interne humaine afin de mieux comprendre les maladies otologiques, telles que la maladie de Ménière, au niveau cellulaire et moléculaire. Cet article décrit une technique de prélèvement d’organes vestibulaires humains à partir d’un donneur vivant dans des conditions physiologiques. Une personne atteinte de la maladie de Ménière et de crises de « gouttes » réfractaires à l’injection intratympanique de gentamicine a subi une labyrinthectomie. Une mastoïdectomie traditionnelle a d’abord été pratiquée, et les canaux semi-circulaires horizontaux et supérieurs (SCC) ont été identifiés. La cavité mastoïdienne a été remplie d’une solution saline équilibrée afin que le labyrinthe puisse être ouvert dans des conditions plus physiologiques afin de préserver l’intégrité cellulaire. Un endoscope à zéro degré ajusté avec un système d’irrigation de gaine de nettoyage de lentille a été utilisé pour visualiser la cavité mastoïdienne submergée, et une meule de diamant de 2 mm a été utilisée pour squelettiser et ouvrir les CSC horizontaux et supérieurs, suivis du vestibule. Les ampoules et la partie des canaux pour les CSC supérieurs et latéraux ont été prélevées. L’utricule a été récolté de la même manière. Les tissus prélevés ont été immédiatement placés dans un tampon glacé, puis fixés pendant une heure dans du paraformaldéhyde à 4 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Le tissu a été rincé plusieurs fois dans 1x PBS et stocké pendant 48 h à 4 °C. Les échantillons de tissus ont subi une immunocoloration avec une combinaison d’anticorps primaires contre la ténascine C (calice), l’oncomoduline (cellules ciliées stréolaires), la calrétinine (calice et cellules ciliées de type II), la protéine de vésicule synaptique 2 (fibres efférentes et boutons), la β-tubuline 1 (calice et boutons afférents), suivie d’une incubation avec des anticorps secondaires conjugués aux fluorophores. Les échantillons de tissus ont ensuite été rincés et montés pour un examen par microscopie confocale. Les images ont révélé la présence de cellules ciliées ambulaires et maculaires et de structures neurales. Ce protocole démontre qu’il est possible de prélever des tissus intacts et de haute qualité de l’oreille interne humaine à partir de donneurs vivants et peut constituer un outil important pour l’étude des maladies otologiques.

Introduction

L’oreille interne humaine vivante est difficile à étudier en raison de son emplacement dans l’os dense de la capsule otique de l’os temporal. Par conséquent, l’accès aux tissus internes humains a été limité, et les chercheurs se sont principalement appuyés sur le prélèvement de tissus post-mortem. L’histopathologie osseuse temporale post-mortem (TBH) est un outil essentiel pour comprendre les maladies otologiques humaines depuis plus de 100 ans ^1,2,3. Les tissus pour la TBH sont préparés par le prélèvement post-mortem de l’os temporal, un long processus de décalcification et de préparation des tissus (9 à 10 mois), suivi d’une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine. Bien que TBH reste un outil essentiel pour révéler de nouvelles informations sur l’oreille interne humaine saine et malade, les longs délais d’autopsie et les méthodes de traitement des tissus longs et difficiles limitent son utilité à certaines fins, nécessitant des méthodes complémentaires pour étudier les tissus de l’oreille interne humaine. L’imagerie par résonance magnétique à haute résolution peut visualiser les organes de l’oreille interne, mais ne dispose pas d’une résolution suffisante pour visualiser les structures au niveau cellulaire ou moléculaire ^4,5. En raison de ces défis, de nombreuses maladies de l’oreille interne humaine restent mal comprises.

Une autre approche consiste à prélever du tissu de l’oreille interne pendant la chirurgie. Lors d’une labyrinthectomie ou d’une résection translabyrinthique du schwannome vestibulaire, les tissus de l’oreille interne sont intentionnellement sacrifiés. Des utricules prélevés chez des patients lors de la résection translabyrinthique du schwannome vestibulaire ont été utilisés pour caractériser la morphologie des cellules ciliées vestibulaires ^6,7,8 et étudier la régénération des cellules ciliées ^9,10. Plus récemment, des techniques ont été mises au point pour prélever des organes de l’oreille interne de donneurs d’organes en utilisant une approche transcanale qui peut être utilisée pour enlever l’utricule et potentiellement d’autres organes vestibulaires à travers une fenêtre ovale élargie avec un traumatisme tissulaire minimal^11,12. Grâce à cette technique, il a été possible de caractériser les profils transcriptomiques unicellulaires de l’utricule humain¹³. Cependant, ces techniques exposent les organes de l’oreille interne à des conditions non physiologiques pendant la récolte. Plus précisément, les organes de l’oreille interne peuvent être exposés à l’absence de liquide périlymphatique et à l’immersion dans l’irrigation normale par forage salin, qui a une composition ionique considérablement différente de celle du liquide périlymphatique. De plus, le labyrinthe membraneux déshydraté est difficile à visualiser, même avec le grossissement maximal du microscope opératoire, ce qui rend difficile la dissection chirurgicale atraumatique. Les traumatismes mécaniques peuvent endommager davantage les tissus, et notre expérience anecdotique suggère que les tissus chirurgicaux sont souvent de qualité insuffisante en matière d’immunocoloration en raison de dommages mécaniques et de dégénérescence cellulaire. Il est nécessaire de mettre au point de nouvelles techniques pour prélever de manière atraumatique des tissus de l’oreille interne humaine pour des études biologiques qui pourraient élucider des maladies de l’oreille interne humaine mal comprises. Nous décrivons ici une technique sous-marine de prélèvement d’organes vestibulaires humains dans des conditions plus physiologiques lors d’une labyrinthectomie et de leur analyse à l’aide de l’immunomarquage.

Protocole

Ce protocole a été élaboré avec l’approbation du comité d’examen institutionnel (IRB) de la faculté de médecine de l’Université Johns Hopkins (IRB00203441) et conformément aux politiques de l’établissement pour l’utilisation de tissus humains et de matériel potentiellement infectieux. Le prélèvement de tissus a été effectué lors de la labyrinthectomie, qui fait partie des soins cliniques standard pour la maladie de Ménière récalcitrante avec crises de gouttes.

1. Labyrinthectomie et prélèvement de tissus

1. Obtenir l’approbation du conseil d’examen institutionnel local (IRB), examiner les politiques institutionnelles relatives à l’utilisation de matériel humain et infectieux et obtenir le consentement au don de tissus avant d’utiliser ce protocole. Effectuer un prélèvement de tissus lors d’une labyrinthectomie chirurgicale ou d’une approche translabyrinthique du conduit auditif interne, qui fait partie des soins cliniques standard.
2. Préparez le patient.
   1. Avant l’induction de l’anesthésie, discutez avec l’équipe d’anesthésie de la possibilité d’éviter une paralysie à longue durée d’action afin que le nerf facial puisse être surveillé.
   2. Une fois l’anesthésie générale induite, intubez le patient et faites pivoter la table d’opération de 180°. Placez des électrodes de surveillance des nerfs faciaux et assurez-vous qu’une antibioprophylaxie préopératoire est administrée.
   3. Injectez 1 % de lidocaïne avec 1:100 000 d’épinéphrine dans le conduit auditif externe et la région postauriculaire. Préparez l’oreille de manière standard en utilisant de la bétadine.
3. À l’aide d’une lame #15, créez une incision curviligne postauriculaire standard (5-6 cm) à 1 cm en arrière du pli postauriculaire.
4. Liftez les tissus mous postauriculaires.
   1. Identifiez le fascia temporal vers le haut et élevez le lambeau cutané postauriculaire vers l’avant vers le conduit auditif.
   2. Créez une incision périostée standard en forme de 7 et élevez le périoste vers l’avant jusqu’à ce que la colonne vertébrale de Henle et le conduit auditif osseux soient identifiés. Placez des écarteurs d’auto-recyclage.
5. Effectuer une mastoïdectomie.
   1. Effectuer une mastoïdectomie complète, en identifiant le tegmen en haut, le sinus sigmoïde en arrière et en amincissant le conduit auditif externe en avant.
   2. Identifiez le canal semi-circulaire horizontal et le processus court de l’incus.
      REMARQUE : La mastoïde ne doit pas être soucoupe pour s’assurer qu’elle reste un récipient capable de contenir du liquide pour la collecte de tissus sous-marins.
6. Identifiez les canaux semi-circulaires (SC).
   1. Sous le microscope opératoire (grossissement de 2 à 4x), utilisez une meule diamantée grossière de 3 mm pour enlever les cellules d’air périlabyrinthiques latérales au SC supérieur, les cellules d’air subarquées et les cellules d’air rétro-labyrinthiques derrière le SC postérieur, s’étendant au-dessus des crus communs.
7. Immergez le labyrinthe.
   1. Immergez la cavité mastoïdienne dans une solution saline équilibrée (BSS) et visualisez le labyrinthe à l’aide d’un endoscope à zéro degré avec un système d’irrigation par gaine de nettoyage de lentille.
   2. Utilisez le système d’irrigation de la gaine de nettoyage des lentilles pour irriguer la cavité mastoïdienne avec du BSS, en éliminant le sang et en permettant une meilleure visualisation du labyrinthe.
8. CS de la ligne bleue.
   1. Tout en maintenant un niveau adéquat de BSS dans la cavité mastoïdienne et en utilisant l’endoscope pour la visualisation, utilisez une fraise diamantée de 3 mm pour « ligner bleue » les trois canaux semi-circulaires en forant soigneusement l’os de la capsule otique jusqu’à ce que le canal semi-circulaire apparaisse comme une ligne bleuâtre lorsqu’il est observé avec l’endoscope.
   2. Irriguer par intermittence avec une solution de BSS en utilisant le système d’irrigation pour éliminer le sang et obtenir une visualisation adéquate, comme illustré à la figure 1.
9. Récolte SC ampullae.
   1. Sous BSS, entrez dans le dôme du canal semi-circulaire latéral et suivez-le vers l’avant jusqu’à ce que ses ampoules soient identifiées. Entrez dans le SC supérieur et suivez-le médialement vers ses ampoules, qui peuvent être récoltées avec les ampoules du SC supérieur. Coupez brusquement le canal SC latéral pour faciliter l’élimination.
   2. Élevez les ampoules SC horizontales et supérieures des crêtes à l’aide d’une aiguille de Rosen et séparez les fibres afférentes de l’épithélium et du labyrinthe membraneux. Ensuite, supprimez ces structures.
   3. Transecter le dôme du SC postérieur et le suivre en bas et en avant jusqu’à ses ampules. De même, prélevez les ampoules SC postérieures et placez tous les tissus dans le BSS sur de la glace.
10. Récoltez la macula.
    1. Retirez l’os entre les ampoules SC horizontales et postérieures pour exposer le vestibule. Les parois membraneuses de l’utricule auront été déchirées lors de l’ablation des ampules. Tant qu’un niveau de liquide est maintenu, les macules resteront attachées antérieurement ; Élevez-le et retirez-le.
    2. Le saccule se trouve dans le renfoncement sphérique ; Soulevez-le brusquement et retirez-le de l’évidement. De même, placez les échantillons de tissus dans le BSS sur de la glace.
11. Transporter des échantillons de tissus sur glace de la salle d’opération au laboratoire pour fixation dans l’heure suivant le prélèvement.

2. Immunohistochimie et imagerie

1. Corrigez l’échantillon.
   1. Placez l’échantillon de tissu dans du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) dans 1 solution saline tamponnée au phosphate (1 PBS) à température ambiante (RT) avec balancement doux ou agitation orbitale (100 tr/min) pendant 1 h.
      REMARQUE : Solution PFA à 4 % (pour 5 mL au total) : 625 mL de solution mère PFA à 32 % + 500 mL de 10xPBS + 3875 mL de ddH₂O.
2. Transférez les échantillons de tissus dans 1 solution PBS et rincez 3 x 15 min (ou plus si nécessaire) à RT avec un balancement doux ou une agitation orbitale.
3. Retirez l’excès de tissu conjonctif sous le microscope de dissection dans 1x PBS à RT.
4. Détartrez l’échantillon.
   1. Transférez des échantillons de tissus à 5 % d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans une solution 1x PBS pour débarrasser l’épithélium sensoriel des débris osseux fins et de l’otoconie. Faites fonctionner l’incubation pendant 15 à 30 minutes à RT, avec un léger balancement ou une agitation orbitale.
5. Encore une fois, transférez les échantillons de tissus dans 1 solution PBS et rincez 3 x 15 min (ou plus si nécessaire) à RT avec un balancement doux ou une agitation orbitale.
6. Appliquer 125 à 200 mL de 2 tampons de blocage (2 BB) sur chaque échantillon et incuber pendant 1,5 à 5 h à RT ou toute la nuit (ON) à 4 °C. Exécutez l’incubation sous une agitation orbitale constante.
   REMARQUE : 2x Tampon de blocage (2x BB) : 1 g d’albumine sérique bovine (BSA) dissoute dans jusqu’à 5 mL de 1x PBS complété par 0,5 % de Triton X-100. Le BSA sert d’agent bloquant pour les sites de liaison d’antigènes non spécifiques.
7. Coloration à l’aide d’anticorps primaires.
   1. Appliquez 120 à 150 ml d’une combinaison d’anticorps primaires dissous dans 1x BB à la dilution désirée. Appliquer des anticorps anti-ténascine C de lapin à une dilution de 1:200 (2,5 μg/mL), des anticorps anti-oncomoduline de chèvre à une dilution de 1:200 (2,5 μg/mL), un anticorps anti-calrétinine de souris à une dilution de 1:300 (2,2 μg/mL) et du DAPI à une dilution de 1:1000 (1 μg/mL). Ensuite, transférez l’échantillon (couvert) à 4 °C (réfrigérateur ou chambre froide) sous une légère agitation orbitale pour une incubation ON.
      REMARQUE : 1x BB : Mélanger un volume égal de 2x BB et 1x PBS complété par 0,5 % de Triton X-100.
8. Rincer les échantillons de tissus dans 1 solution PBS, 3 x 15 min (ou plus si nécessaire), à RT avec un balancement doux.
9. Coloration à l’aide d’anticorps secondaires.
   1. Appliquer 120 à 150 mL d’une combinaison d’anticorps secondaires conjugués aux fluorophores dissous dans 1 BB à une dilution de 1:2000 (1 μg/mL). Appliquez un anticorps secondaire anti-lapin conjugué de 488 nm, un anticorps secondaire anti-souris de 568 nm et un anticorps secondaire anti-chèvre de 647 nm.
   2. Ensuite, incubez l’échantillon (couvert) à RT sous une légère agitation orbitale pendant 1,5 à 2 h (ou ON à 4 °C).
10. Rincer les échantillons de tissus dans 1 solution PBS, 3 x 15 min (ou plus si nécessaire), à RT avec un balancement doux.
11. Effectuez la microdissection et le montage.
    1. Sous le microscope à dissection, retirez l’excès de tissu et de membranes autour des épithéliums vestibulaires sensoriels. Utilisez de l’éthanol à 70 % pour nettoyer la surface d’une lame d’histologie en verre, séchez-la à l’air libre et appliquez une goutte de 55 ml du milieu de montage approprié.
    2. Transférez les échantillons de tissus sensoriels sur le support de montage. À l’aide d’une pince fine, orientez doucement les échantillons avec le faisceau de cheveux vers le haut dans le support de montage.
    3. Posez délicatement un verre de protection de la taille appropriée sur le support de montage contenant les échantillons, en essayant de limiter les bulles d’air. Assurez-vous que le verre de protection est d’une épaisseur #1,5 requise pour la microscopie confocale.
    4. Placez les glissières dans un endroit sombre (par exemple, un tiroir d’établi) pour laisser le support de montage prendre. Scellez le verre de protection sur la lame à l’aide d’un vernis à ongles transparent et laissez-le sécher dans un endroit sombre avant de l’examiner avec le microscope confocal. Ensuite, conservez les lames scellées dans l’obscurité (boîte de diapositives de la chemise de diapositives) à 4° jusqu’à l’imagerie.
12. Utilisez un microscope confocal à un grossissement de 40x-100x avec des canaux de 488 nm et 657 nm pour imager l’échantillon.

Résultats

Grâce à cette technique, l’utricule humain et les ampoules du canal latéral et supérieur ont été prélevés intacts avec un traumatisme minimal (Figure 2). Comme on peut le voir sur la figure 2, les ampoules peuvent être récoltées avec une partie substantielle du canal membraneux. Le marquage immunofluorescent avec de l’anti-ténascine C (protéine de la matrice extracellulaire) et de l’anti-oncomoduline (petite p...

Discussion

Cet article décrit une nouvelle technique de prélèvement sous-marin d’organes vestibulaires terminaux dans la BSS à l’aide d’endoscopes et leur analyse à l’aide de l’imagerie immunofluorescente. Ici, nous démontrons la récolte d’organes vestibulaires terminaux intacts avec des cellules ciliées vestibulaires intactes et une qualité tissulaire suffisante pour un immunomarquage réussi. La densité des cellules ciliées de notre échantillon était similaire à celles o...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Phosphate Buffered Saline Stock	Sigma-Aldrich	P5493
32% Paraformaldehyde Stock Solution	ThermoFisher Scientific	50-980-495
Alexa Fluor 488 Anti-Rabbit Secondary Antibody	Jackson Immunoresearch	111545144
Alexa Fluor 568 Anti-Mouse Secondary Antibody	Jackson Immunoresearch	115575146
Alexa Fluor 647 Anti-Goat Secondary Antibody	Jackson Immunoresearch	705607003
Balanced Salt Solution	ThermoFisher Scientific	14040117
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	10711454001
Confocal microscope	Nikon A1	A1
Cover glass (18 mm x 18 mm, thickness #1.5 )	Corning	2850-18
Endo-Scrub 2 Lens Cleaning Sheath	Medtronic	IPCES2SYSKIT
Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) Acid Solution	Sigma-Aldrich	E8008
Goat Anti-oncomodulin Antibody	R&D Systems	AF6345
Hopkins 0 Degree Telescope	Karl Storz
Mouse Anti-calretinin Antibody	BD Biosciences	610908
ProLong Gold antifade reagent	Invitrogen	P10144
Rabbit Anti-tenascin C Antibody	Millipore	AB19013
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5