Prelievo di organi terminali vestibolari in condizioni fisiologiche durante la labirintectomia

Riepilogo

Qui, descriviamo una tecnica per il prelievo di organi terminali vestibolari umani in condizioni fisiologiche durante la labirintectomia e la loro analisi mediante immunocolorazione.

Abstract

L'orecchio interno umano vivente è difficile da studiare perché è racchiuso all'interno di un denso osso della capsula otica che limita l'accesso al tessuto biologico. I metodi tradizionali di istopatologia dell'osso temporale si basano su protocolli di decalcificazione lunghi e costosi che richiedono 9-10 mesi e riducono i tipi di analisi dei tessuti possibili a causa della degradazione dell'RNA. C'è un bisogno critico di sviluppare metodi per accedere al tessuto umano fresco dell'orecchio interno per comprendere meglio le malattie otologiche, come la malattia di Ménière, a livello cellulare e molecolare. Questo articolo descrive una tecnica per il prelievo di organi terminali vestibolari umani da un donatore vivente in condizioni fisiologiche. Un individuo con malattia di Ménière e "attacchi di gocce" refrattari all'iniezione intratimpanica di gentamicina è stato sottoposto a labirintectomia. Per prima cosa è stata eseguita una mastoidectomia tradizionale e sono stati identificati i canali semicircolari orizzontali e superiori (SCC). La cavità mastoidea è stata riempita con una soluzione salina bilanciata in modo che il labirinto potesse essere aperto in condizioni più fisiologiche per preservare l'integrità cellulare. Per visualizzare la cavità mastoidea sommersa è stato utilizzato un endoscopio a zero gradi con un sistema di irrigazione della guaina per la pulizia delle lenti e una fresa diamantata da 2 mm per scheletrare e aprire le SCC orizzontali e superiori, seguite dal vestibolo. Sono state raccolte le ampolle e la parte dei condotti del canale per le SCC superiori e laterali. L'utricolo è stato raccolto in modo simile. Il tessuto prelevato è stato immediatamente posto in un tampone ghiacciato e poi fissato per un'ora in paraformaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Il fazzoletto è stato risciacquato più volte in 1x PBS e conservato per 48 ore a 4 °C. I campioni di tessuto sono stati sottoposti a immunocolorazione con una combinazione di anticorpi primari contro la tenascina-C (Calyx), oncomodulina (cellule ciliate streolari), calretinina (Calyx e cellule ciliate di tipo II), proteina 2 della vescicola sinaptica (fibre efferenti e bottoni), β-tubulina 1 (calice e bottoni afferenti), seguita da incubazione con anticorpi secondari coniugati con fluoroforo. I campioni di tessuto sono stati quindi risciacquati e montati per l'esame al microscopio confocale. Le immagini hanno rivelato la presenza di cellule ciliate e strutture neurali ampolari e maculari. Questo protocollo dimostra che è possibile prelevare tessuto umano intatto e di alta qualità dell'orecchio interno da donatori viventi e può fornire uno strumento importante per lo studio della malattia otologica.

Introduzione

L'orecchio interno umano vivente è difficile da studiare a causa della sua posizione all'interno dell'osso denso della capsula otica dell'osso temporale. Di conseguenza, l'accesso al tessuto interno umano è stato limitato e i ricercatori si sono affidati principalmente alla raccolta di tessuti post-mortem. L'istopatologia ossea temporale post-mortem (TBH) è stata uno strumento fondamentale per comprendere la malattia otologica umana per oltre ^{100 anni 1,2,3}. Il tessuto per il TBH viene preparato mediante il prelievo post-mortem dell'osso temporale, un lungo processo di decalcificazione (9-10 mesi) e preparazione del tessuto, seguito da colorazione con ematossilina ed eosina. Mentre il TBH rimarrà uno strumento essenziale per rivelare nuove informazioni sull'orecchio interno umano sano e malato, i lunghi tempi post-mortem e i metodi di lavorazione dei tessuti lunghi e duri ne limitano l'utilità per determinati scopi, rendendo necessari metodi aggiuntivi per studiare il tessuto dell'orecchio interno umano. La risonanza magnetica ad alta risoluzione è in grado di visualizzare gli organi dell'orecchio interno, ma non dispone di una risoluzione sufficiente per visualizzare le strutture a livello cellulare o molecolare ^4,5. A causa di queste sfide, molte malattie dell'orecchio interno umano rimangono poco comprese.

Un approccio alternativo consiste nel raccogliere il tessuto dell'orecchio interno durante l'intervento chirurgico. Durante la labirintectomia o la resezione dello schwannoma vestibolare translabirintico, i tessuti dell'orecchio interno vengono intenzionalmente sacrificati. Gli utricoli prelevati dai pazienti durante la resezione dello schwannoma vestibolare translabirintico sono stati utilizzati per caratterizzare la morfologia delle cellule ciliate vestibolari ^6,7,8 e studiare la rigenerazione delle cellule ciliate ^9,10. Più recentemente, sono state sviluppate tecniche per prelevare organi dell'orecchio interno da donatori di organi utilizzando un approccio transcanale che può essere utilizzato per rimuovere l'utricolo e potenzialmente altri organi terminali vestibolari attraverso una finestra ovale allargata con un trauma tissutale minimo^11,12. Utilizzando questa tecnica, è stato possibile caratterizzare profili trascrittomici a singola cellula per l'utricolo umano¹³. Tuttavia, queste tecniche espongono gli organi dell'orecchio interno a condizioni non fisiologiche durante il prelievo. In particolare, gli organi dell'orecchio interno possono essere esposti all'assenza di liquido perilinfatico e all'immersione nella normale irrigazione con trapano salino, che ha una composizione ionica sostanzialmente diversa rispetto al liquido perilinfatico. Inoltre, il labirinto membranoso disidratato è difficile da visualizzare, anche con l'ingrandimento massimo del microscopio operatorio, il che rende difficile la dissezione chirurgica atraumatica. Il trauma meccanico può danneggiare ulteriormente i tessuti e la nostra esperienza aneddotica suggerisce che il tessuto chirurgico è spesso di qualità insufficiente di immunocolorazione a causa di danni meccanici e degenerazione cellulare. C'è bisogno di nuove tecniche per raccogliere in modo atraumatico il tessuto dell'orecchio interno umano per studi biologici che possano chiarire le malattie dell'orecchio interno umano poco comprese. Qui descriviamo una tecnica subacquea per il prelievo di organi terminali vestibolari umani in condizioni più fisiologiche durante la labirintectomia e la loro analisi mediante immunocolorazione.

Protocollo

Questo protocollo è stato sviluppato con l'approvazione dell'institutional review board (IRB) della Johns Hopkins University School of Medicine (IRB00203441) e secondo le politiche istituzionali per l'utilizzo di tessuti umani e materiale potenzialmente infettivo. La raccolta dei tessuti è stata eseguita durante la labirintectomia, che fa parte delle cure cliniche standard per la malattia di Ménière recalcitrante con attacchi a goccia.

1. Labirintotectomia e prelievo di tessuti

1. Ottenere l'approvazione del consiglio di revisione istituzionale locale (IRB), rivedere le politiche istituzionali per l'uso di materiale umano e infettivo e ottenere il consenso per la donazione di tessuti prima di utilizzare questo protocollo. Eseguire il prelievo di tessuto durante la labirintectomia chirurgica o l'approccio translabirintico al canale uditivo interno, che fa parte dell'assistenza clinica standard.
2. Preparare il paziente.
   1. Prima dell'induzione dell'anestesia, discutere con l'équipe di anestesia la prevenzione della paralisi a lunga durata d'azione in modo che il nervo facciale possa essere monitorato.
   2. Una volta indotta l'anestesia generale, intubare il paziente e ruotare il tavolo operatorio di 180°. Posizionare gli elettrodi di monitoraggio del nervo facciale e assicurarsi che venga somministrata la profilassi antibiotica preoperatoria.
   3. Iniettare lidocaina all'1% con epinefrina 1:100.000 nel canale uditivo esterno e nell'area postauricolare. Preparare l'orecchio nel modo standard utilizzando betadine.
3. Usa una lama #15 per creare un'incisione curvilinea postauricolare standard (5-6 cm) 1 cm dietro la piega postauricolare.
4. Sollevare i tessuti molli postauricolari.
   1. Identificare la fascia temporale superiormente ed elevare il lembo cutaneo postauricolare anteriormente verso il condotto uditivo.
   2. Creare un'incisione periostale standard a forma di 7 ed elevare il periostio anteriormente fino a identificare la colonna vertebrale di Henle e il condotto uditivo osseo. Posizionare i divaricatori di autoaddestramento.
5. Eseguire la mastoidectomia.
   1. Eseguire una mastoidectomia completa, identificando il tegmen superiormente, il seno sigmoideo posteriormente e assottigliando il canale uditivo esterno anteriormente.
   2. Identificare il canale semicircolare orizzontale e il breve processo dell'incudine.
      NOTA: La mastoide non deve essere saucerizzata per garantire che rimanga un recipiente in grado di contenere liquidi per la raccolta di tessuti subacquei.
6. Identificare i canali semicircolari (SC).
   1. Al microscopio operatorio (ingrandimento 2-4x), utilizzare una fresa diamantata grossolana da 3 mm per rimuovere le celle d'aria perilabirintiche lateralmente al SC superiore, le celle d'aria subarcuate e le celle d'aria retro-labirintiche dietro il SC posteriore, che si estendono superiormente al crus comune.
7. Immergi il labirinto.
   1. Immergere la cavità mastoidea in una soluzione salina bilanciata (BSS) e visualizzare il labirinto utilizzando un endoscopio a zero gradi con un sistema di irrigazione a guaina per la pulizia delle lenti.
   2. Utilizzare il sistema di irrigazione della guaina di pulizia delle lenti per irrigare la cavità mastoidea con BSS, lavando via il sangue e consentendo una migliore visualizzazione del labirinto.
8. SC della linea blu.
   1. Mantenendo un livello adeguato di BSS nella cavità mastoidea e utilizzando l'endoscopio per la visualizzazione, utilizzare una fresa diamantata da 3 mm per "allineare in blu" tutti e tre i canali semicircolari perforando accuratamente l'osso della capsula otica fino a quando il canale semicircolare appare come una linea bluastra quando viene visualizzato con l'endoscopio.
   2. Irrigare in modo intermittente con la soluzione BSS utilizzando il sistema di irrigazione per lavare via il sangue e ottenere una visualizzazione adeguata, come illustrato nella Figura 1.
9. Raccogliere le fiale SC.
   1. Sotto BSS, si entra nella cupola del canale semicircolare laterale e lo si segue anteriormente fino a quando non si identificano le sue ampolle. Entrare nel SC superiore e seguirlo medialmente verso le sue ampolle, che possono essere prelevate con le ampolle del SC superiore. Tagliare bruscamente il dotto SC laterale per facilitare la rimozione.
   2. Sollevare le ampolle SC orizzontali e superiori dalla crista utilizzando un ago Rosen e separare le fibre afferenti dagli epiteli e dal labirinto membranoso. Quindi, rimuovi queste strutture.
   3. Sezionare la cupola del SC posteriore e seguirla inferiormente e anteriormente alle sue ampolle. Allo stesso modo, raccogliere le fiale SC posteriori e posizionare tutto il tessuto in BSS sul ghiaccio.
10. Macula del raccolto.
    1. Rimuovere l'osso tra le ampolle SC orizzontali e posteriori per esporre il vestibolo. Le pareti membranose dell'utricolo saranno state strappate con l'asportazione delle ampolle. Finché viene mantenuto un livello di liquido, le macule rimarranno attaccate anteriormente; Sollevarlo e rimuoverlo.
    2. Il sacculo si trova all'interno della rientranza sferica; Sollevarlo bruscamente e rimuoverlo dall'incavo. Allo stesso modo, posizionare i campioni di tessuto in BSS su ghiaccio.
11. Trasportare campioni di tessuto su ghiaccio dalla sala operatoria al laboratorio per la fissazione entro 1 ora dal prelievo.

2. Immunoistochimica e imaging

1. Correggere l'esempio.
   1. Immergere il campione di tessuto in paraformaldeide al 4% (PFA) in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS) a temperatura ambiente (RT) con un leggero oscillazione o agitazione orbitale (100 giri/min) per 1 ora.
      NOTA: Soluzione di PFA al 4% (per un totale di 5 mL): 625 mL di soluzione madre di PFA al 32% + 500 mL di 10xPBS + 3875 mL di ddH₂O.
2. Trasferire i campioni di tessuto in 1 soluzione PBS e risciacquare 3 volte per 15 minuti (o più a lungo se necessario) a RT con un leggero dondolio o agitazione orbitale.
3. Rimuovere il tessuto connettivo in eccesso al microscopio da dissezione in 1x PBS a RT.
4. Decalcificare il campione.
   1. Trasferire campioni di tessuto in acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) al 5% in una soluzione 1x PBS per eliminare gli epiteli sensoriali dai detriti ossei fini e dall'otoconia. Eseguire l'incubazione per 15-30 minuti a RT, con un leggero dondolio o agitazione orbitale.
5. Anche in questo caso, trasferire i campioni di tessuto in 1 soluzione PBS e risciacquare 3 volte per 15 minuti (o più a lungo se necessario) a RT con un leggero dondolio o agitazione orbitale.
6. Applicare 125-200 mL di tampone bloccante 2x (2x BB) su ciascun campione e incubare per 1,5-5 ore a RT o durante la notte (ON) a 4 °C. Eseguire l'incubazione sotto costante agitazione orbitale.
   NOTA: 2x Tampone bloccante (2x BB): 1 g di albumina sierica bovina (BSA) disciolta in un massimo di 5 mL di 1x PBS integrato con Triton X-100 allo 0,5%. Il BSA funge da agente bloccante per i siti di legame dell'antigene non specifici.
7. Colorare con gli anticorpi primari.
   1. Applicare 120-150 mL di una combinazione di anticorpi primari disciolti in 1x BB alla diluizione desiderata. Applicare gli anticorpi anti-tenacina-C di coniglio alla diluizione 1:200 (2,5 μg/mL), gli anticorpi anti-oncomodulina di capra alla diluizione 1:200 (2,5 μg/mL), l'anti-calretinina di topo alla diluizione 1:300 (2,2 μg/mL) e il DAPI alla diluizione 1:1000 (1 μg/mL). Quindi, trasferire il campione (coperto) a 4 °C (frigorifero o cella frigorifera) sotto un leggero agitamento orbitale per l'incubazione ON.
      NOTA: 1x BB: Mescolare un volume uguale di 2x BB e 1x PBS integrati con Triton X-100 allo 0,5%.
8. Sciacquare i campioni di tessuto in 1 soluzione PBS, 3 volte per 15 minuti (o più a lungo se necessario), a RT con un leggero oscillamento.
9. Colorare con anticorpi secondari.
   1. Applicare 120-150 mL di una combinazione di anticorpi secondari coniugati con fluorofori disciolti in 1x BB alla diluizione 1:2000 (1 μg/mL). Applicare un anticorpo secondario coniugato anti-coniglio da 488 nm, un anticorpo secondario anti-topo da 568 nm e un anticorpo secondario anti-capra da 647 nm.
   2. Quindi, incubare il campione (coperto) a RT con un leggero agitamento orbitale per 1,5-2 ore (o ON a 4 °C).
10. Sciacquare i campioni di tessuto in 1 soluzione PBS, 3 volte per 15 minuti (o più a lungo se necessario), a RT con un leggero oscillamento.
11. Eseguire la microdissezione e il montaggio.
    1. Al microscopio da dissezione, rimuovere il tessuto e le membrane in eccesso intorno agli epiteli vestibolari sensoriali. Utilizzare etanolo al 70% per pulire la superficie di un vetrino istologico in vetro, asciugare all'aria e applicare una goccia da 55 ml del terreno di montaggio appropriato.
    2. Trasferire i campioni di tessuto sensoriale nel mezzo di montaggio. Utilizzare una pinza fine per orientare delicatamente i campioni con il fascio di capelli rivolto verso l'alto nel mezzo di montaggio.
    3. Appoggiare delicatamente un vetro di copertura di dimensioni adeguate sul supporto di montaggio contenente i campioni, cercando di limitare le bolle d'aria. Assicurarsi che il vetro di copertura sia del grado di spessore #1.5 richiesto per la microscopia confocale.
    4. Posizionare le guide in un'area buia (ad es. un cassetto del banco) per consentire l'impostazione del supporto di montaggio. Sigillare il vetro di copertura sul vetrino con uno smalto trasparente e lasciarlo asciugare in un'area scura prima di esaminarlo con il microscopio confocale. Successivamente, conservare i vetrini sigillati al buio (scatola dei vetrini della cartella dei vetrini) a 4° fino all'imaging.
12. Utilizzare un microscopio confocale con ingrandimento 40x-100x con canali da 488 nm e 657 nm per visualizzare il campione.

Risultati

Utilizzando questa tecnica, l'utricolo umano e le ampolle del canale laterale e superiore sono stati prelevati intatti con un trauma minimo (Figura 2). Come si può vedere nella Figura 2, le ampolle possono essere prelevate con una porzione sostanziale del dotto membranoso. La marcatura immunofluorescente con anti-tenascicina-C (proteina della matrice extracellulare) e anti-oncomodulina (piccola proteina legante il calcio della ...

Discussione

Questo articolo descrive una nuova tecnica per il prelievo subacqueo di organi terminali vestibolari nella BSS utilizzando endoscopi e la loro analisi mediante imaging immunofluorescente. Qui, dimostriamo il prelievo di organi terminali vestibolari intatti con cellule ciliate vestibolari intatte e una qualità tissutale sufficiente per il successo dell'immunomarcatura. La densità delle cellule ciliate nel nostro campione era simile a quella ottenuta in altri studi da donatori di organi ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Phosphate Buffered Saline Stock	Sigma-Aldrich	P5493
32% Paraformaldehyde Stock Solution	ThermoFisher Scientific	50-980-495
Alexa Fluor 488 Anti-Rabbit Secondary Antibody	Jackson Immunoresearch	111545144
Alexa Fluor 568 Anti-Mouse Secondary Antibody	Jackson Immunoresearch	115575146
Alexa Fluor 647 Anti-Goat Secondary Antibody	Jackson Immunoresearch	705607003
Balanced Salt Solution	ThermoFisher Scientific	14040117
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	10711454001
Confocal microscope	Nikon A1	A1
Cover glass (18 mm x 18 mm, thickness #1.5 )	Corning	2850-18
Endo-Scrub 2 Lens Cleaning Sheath	Medtronic	IPCES2SYSKIT
Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) Acid Solution	Sigma-Aldrich	E8008
Goat Anti-oncomodulin Antibody	R&D Systems	AF6345
Hopkins 0 Degree Telescope	Karl Storz
Mouse Anti-calretinin Antibody	BD Biosciences	610908
ProLong Gold antifade reagent	Invitrogen	P10144
Rabbit Anti-tenascin C Antibody	Millipore	AB19013
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5