Labyrinthectomy 중 생리학적 조건 하에서 전정 말단 장기의 수확

요약

여기에서는 미로 절제술 중 생리학적 조건에서 인간 전정 말단을 적출하는 기술과 면역 염색을 사용한 분석에 대해 설명합니다.

초록

살아 있는 인간의 내이는 조밀한 이낭 뼈 안에 둘러싸여 있어 생체 조직에 대한 접근을 제한하기 때문에 연구하기가 어렵습니다. 기존의 측두골 조직병리학 방법은 9-10개월이 걸리는 길고 비용이 많이 드는 석회질 제거 프로토콜에 의존하며 RNA 분해로 인해 가능한 조직 분석 유형을 줄입니다. 세포 및 분자 수준에서 메니에르병과 같은 이과 질환을 더 잘 이해하기 위해 새로운 인간 내이 조직에 접근할 수 있는 방법을 개발하는 것이 매우 중요합니다. 이 논문은 생리학적 조건에서 살아있는 기증자로부터 인간 전정 말단 기관을 적출하는 기술을 설명합니다. 메니에르병(Ménière's disease)과 고막내 겐타마이신 주사에 불응하는 '방울 발작'을 앓고 있는 한 환자가 미로 절제술을 받았습니다. 전통적인 유양돌기 절제술이 먼저 시행되었고, 수평 및 상반고리관(SCC)이 확인되었습니다. 유양돌기 공동은 균형 잡힌 소금 용액으로 채워져 미로가 세포의 무결성을 보존하기 위해 더 많은 생리학적 조건에서 열릴 수 있었습니다. 렌즈 세척 시스 관개 시스템이 장착된 0도 내시경을 사용하여 수중 유양돌기 공동을 시각화하고, 2mm 다이아몬드 버를 사용하여 수평 및 상부 SCC와 현관을 골격화하고 열었습니다. 상부 및 측면 SCC를 위한 ampullae 및 운하 덕트의 일부를 수확했습니다. 난소도 비슷하게 채취되었다. 수확된 조직을 즉시 얼음처럼 차가운 완충액에 넣은 다음 인산염 완충 식염수(PBS)의 4% 파라포름알데히드에 1시간 동안 고정했습니다. 조직을 1x PBS에서 여러 번 헹구고 4°C에서 48시간 동안 보관했습니다. 조직 샘플은 tenascin-C(꽃받침), 온코모듈린(줄무늬 유모 세포), 칼레티닌(꽃받침 및 II형 유모 세포), 시냅스 소포 단백질 2(원심성 섬유 및 부톤), β-튜불린 1(꽃받침 및 구심성 부톤)에 대한 1차 항체의 조합으로 면역염색을 거친 후 형광단 접합 2차 항체로 배양했습니다. 그런 다음 조직 샘플을 헹구고 컨포칼 현미경 검사를 위해 장착했습니다. 이미지는 앰풀라 및 황반 유모 세포와 신경 구조의 존재를 보여주었습니다. 이 프로토콜은 살아있는 기증자로부터 손상되지 않은 고품질 인간 내이 조직을 채취하는 것이 가능하며 이과 질환 연구에 중요한 도구를 제공할 수 있음을 보여줍니다.

서문

살아있는 인간의 내이는 측두골의 조밀한 이낭 뼈 내에 위치하기 때문에 연구하기가 어렵습니다. 그 결과, 인간의 내부 조직에 대한 접근이 제한되었고, 연구자들은 주로 사후 조직 적출에 의존해 왔습니다. 사후 측두골 조직병리학(TBH)은 100년 이상 동안 인간의 이과 질환을 이해하는 데 중요한 도구였습니다 ^1,2,3. TBH를 위한 조직은 측두골의 사후 적출, 장시간(9-10개월) 석회질 제거 및 조직 준비 과정, 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 준비됩니다. TBH는 건강하고 병든 인간 내이에 대한 새로운 정보를 밝히는 데 필수적인 도구로 남을 것이지만, 긴 사후 분석 시간과 길고 가혹한 조직 처리 방법으로 인해 특정 목적에 대한 유용성이 제한되어 인간 내이 조직을 연구하기 위한 보조 방법이 필요합니다. 고해상도 자기공명영상(MRI)은 내이 장기를 시각화할 수 있지만 세포 또는 분자 수준에서 구조를 볼 수 있는 충분한 해상도가 부족합니다 ^4,5. 이러한 어려움으로 인해 많은 인간 내이 질환에 대한 이해가 제대로 이루어지지 않고 있습니다.

또 다른 방법은 수술 중에 내이 조직을 채취하는 것입니다. 미로 절제술 또는 미로 전정 슈완종 절제술 중에는 내이 조직을 의도적으로 희생합니다. 경미로 전정 슈완종 절제 중 환자로부터 채취한 난소는 전정 유모 세포 형태를 특성화하고 유모 세포 재생을 연구하는 데 사용되었습니다 ^6,7,8 유모 세포 재생 ^9,10. 보다 최근에는 경운(transcanal) 접근법을 사용하여 장기 기증자로부터 내이 장기를 적출하는 기술이 개발되었는데, 이 접근법은 조직 외상을 최소화하면서 넓어진 타원형 창을 통해 난소 및 잠재적으로 다른 전정 말단 기관을 제거하는 데 사용할 수 있습니다^11,12. 이 기술을 사용하여 인간 난소에 대한 단일 세포 전사체 프로파일을 특성화할 수 있었습니다¹³. 그러나 이러한 기술은 채취 기간 동안 내이 기관을 비생리학적 조건에 노출시킵니다. 구체적으로, 내이 기관은 주림프액이 없는 상태에서 일반 식염수 드릴 관개에 노출될 수 있으며, 이는 주림프액과 상당히 다른 이온 구성을 가지고 있습니다. 또한, 탈수된 막질 미로는 작동 현미경을 최대한 확대해도 시각화하기 어렵기 때문에 외상성 외과적 박리를 어렵게 만듭니다. 기계적 외상은 조직을 더 손상시킬 수 있으며, 우리의 일화적 경험에 따르면 수술 조직은 기계적 손상과 세포 변성으로 인해 면역 염색 품질이 충분하지 않은 경우가 많습니다. 잘 이해되지 않은 인간 내이 질환을 해명할 수 있는 생물학적 연구를 위해 인간의 내이 조직을 외상으로 채취할 수 있는 새로운 기술이 필요합니다. 여기에서는 미로 절제술 중 더 많은 생리학적 조건에서 인간 전정 말단기를 적출하는 수중 기술과 면역 염색을 사용한 분석에 대해 설명합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 존스 홉킨스 의과대학(IRB00203441)의 기관 검토 위원회(IRB)의 승인과 인체 조직 및 감염 가능성이 있는 물질 사용에 대한 기관 정책에 따라 개발되었습니다. 조직 채취는 미로 절제술 중에 수행되었으며, 이는 낙하 발작을 동반한 난치성 메니에르병에 대한 표준 임상 치료의 일부입니다.

1. 미로 절제술 및 조직 채취

1. 이 프로토콜을 활용하기 전에 지역 기관 검토 위원회(IRB) 이사회 승인을 얻고, 인체 및 감염 물질 사용에 대한 기관 정책을 검토하고, 조직 기증에 대한 동의를 얻습니다. 표준 임상 치료의 일부인 내이도에 대한 외과적 미로 절제술 또는 경미로 접근 중에 조직 적출을 수행합니다.
2. 환자를 준비시킵니다.
   1. 마취를 하기 전에 마취 팀과 안면 신경을 모니터링할 수 있도록 장시간 지속되는 마비를 피하는 방법에 대해 논의합니다.
   2. 전신 마취가 시작되면 환자를 삽관하고 수술대를 180° 회전시킵니다. 안면 신경 모니터링 전극을 배치하고 수술 전 예방 항생제가 투여되었는지 확인합니다.
   3. 1:100,000 에피네프린이 함유된 1% 리도카인을 외이도와 이후 영역에 주입합니다. 베타딘을 사용하여 표준 방식으로 귀를 준비하십시오.
3. #15 블레이드를 사용하여 귓바퀴 후 주름에서 1cm 뒤에 표준(5-6cm) 귓바퀴 후 곡선 절개를 만듭니다.
4. 이삭후 연조직을 들어 올립니다.
   1. 측두근막(temporalis fascia)을 상부하게 확인하고 이관후 피부 피판을 외이도 쪽으로 앞쪽으로 들어 올립니다.
   2. 표준 7자 모양의 골막 절개를 만들고 Henle의 척추와 뼈 외이도가 확인될 때까지 골막을 앞쪽으로 들어 올립니다. 자체 재교육 리트랙터를 배치합니다.
5. 유양돌기 절제술을 시행합니다.
   1. 완전 유양절제술을 수행하여 tegmen을 상부로, S상 부비동을 후방으로 식별하고 외이도를 전방으로 얇게 만듭니다.
   2. 수평 반고리관과 incus의 짧은 과정을 확인합니다.
      참고: 유양돌기는 수중 조직 수집을 위해 액체를 담을 수 있는 용기로 남아 있도록 접시에 담아서는 안 됩니다.
6. 반고리관(SC)을 식별합니다.
   1. 작동 현미경 (2-4x 배율)에서 3mm 거친 다이아몬드 버를 사용하여 우수한 SC 측면의 미로 주변 공기 세포, 아치형 공기 세포 및 후방 SC 뒤의 미로 주변 공기 세포를 제거하여 공통 crus에 우수하게 확장됩니다.
7. 미로를 잠수시키세요.
   1. 유양돌기 공동을 균형 잡힌 염 용액(BSS)에 담그고 렌즈 세척 칼집 관개 시스템이 있는 0도 내시경을 사용하여 미로를 시각화합니다.
   2. 렌즈 세척 덮개 관개 시스템을 사용하여 유양돌기 구멍에 BSS를 관개하여 혈액을 씻어내고 미로를 더 잘 시각화할 수 있습니다.
8. 블루 라인' SC.
   1. 유양돌기강에서 적절한 수준의 BSS를 유지하고 시각화를 위해 내시경을 사용하는 동안, 내시경으로 볼 때 반고리관이 푸르스름한 선으로 나타날 때까지 귀낭 뼈를 조심스럽게 뚫어 3mm 다이아몬드 버를 사용하여 3개의 반고리관 모두에 '파란색 선'을 그립니다.
   2. 그림 1과 같이 관개 시스템을 사용하여 BSS 솔루션으로 간헐적으로 관개하여 혈액을 씻어내고 적절한 시각화를 달성합니다.
9. 수확 SC ampullae.
   1. BSS에서 측면 반고리관의 돔으로 들어가 앰풀라가 확인될 때까지 이를 전방으로 따라갑니다. 상부 SC에 들어가 상부 SC의 팽대와 함께 수확할 수 있는 팽대를 향해 내측으로 이를 따릅니다. 제거를 용이하게 하기 위해 측면 SC 덕트를 날카롭게 자릅니다.
   2. Rosen 바늘을 사용하여 crista에서 수평적이고 우수한 SC ampullae를 들어 올리고 상피와 막질 미로에서 구심성 섬유를 분리합니다. 그런 다음 이러한 구조를 제거합니다.
   3. 후방 SC의 돔을 횡단하고 이것을 아래쪽과 앞쪽으로 ampullae까지 따라갑니다. 마찬가지로, 후방 SC 앰풀라를 채취하고 BSS의 모든 조직을 얼음 위에 놓습니다.
10. 황반을 수확합니다.
    1. 전정을 노출시키기 위해 수평과 후방 SC ampullae 사이의 뼈를 제거합니다. 난소의 막벽은 팽대가 제거됨에 따라 찢어졌을 것입니다. 유체 수준이 유지되는 한, 황반은 앞쪽에 붙어 있습니다. 그것을 들어 올리고 제거하십시오.
    2. saccule은 구형 오목한 곳에 있습니다. 홈에서 급격히 들어 올려 제거하십시오. 마찬가지로, BSS의 조직 샘플을 얼음 위에 놓습니다.
11. 채취 후 1시간 이내에 고정을 위해 수술실에서 얼음에 담긴 조직 샘플을 실험실로 운반합니다.

2. 면역조직화학 및 이미징

1. 샘플을 수정합니다.
   1. 조직 샘플을 4% 파라포름알데히드(PFA)에 1x 인산염 완충 식염수(1x PBS)에 넣고 실온(RT)에서 1시간 동안 부드러운 흔들기 또는 궤도 흔들기(100rpm)로 합니다.
      참고: 4% PFA 용액(총 5mL): 32% PFA 원액 625mL + 10xPBS 500mL + ddH_2O3875mL.
2. 조직 샘플을 1x PBS 용액으로 옮기고 RT에서 3x 15분(또는 필요한 경우 그 이상)을 부드러운 흔들기 또는 안와 흔들기로 헹굽니다.
3. RT에서 1x PBS의 해부 현미경 아래에서 과도한 결합 조직을 제거합니다.
4. 샘플을 석회질 제거하십시오.
   1. 조직 샘플을 1x PBS 용액에 5% 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 옮겨 미세한 뼈 파편과 이경피에서 감각 상피를 제거합니다. RT에서 15-30분 동안 부드러운 흔들림 또는 안와 흔들림으로 배양을 실행합니다.
5. 다시 조직 샘플을 1x PBS 용액으로 옮기고 RT에서 부드러운 흔들기 또는 안와 흔들기로 3x 15분(또는 필요한 경우 그 이상)으로 헹굽니다.
6. 각 샘플에 125-200mL의 2x 블로킹 버퍼(2x BB)를 적용하고 RT에서 1.5-5시간 동안 또는 4°C에서 밤새(ON) 배양합니다. 지속적인 궤도 흔들림 하에서 배양을 실행합니다.
   참고: 2x 블로킹 버퍼(2x BB): 0.5% Triton X-100이 보충된 최대 5mL의 1x PBS에 용해된 소 혈청 알부민(BSA) 1g. BSA는 비특이적 항원 결합 부위에 대한 차단제 역할을 합니다.
7. 1차 항체를 사용하여 염색합니다.
   1. 1x BB에 용해된 120-150mL의 1차 항체 조합을 원하는 희석액에 적용합니다. 토끼 항-테나신-C 항체는 1:200 희석(2.5 μg/mL), 염소 항-암세포모듈린 항체는 1:200 희석(2.5 μg/mL), 마우스 항-칼레티닌은 1:300 희석(2.2 μg/mL), DAPI는 1:1000 희석(1 μg/mL)으로 적용합니다. 그런 다음 ON 배양을 위해 부드러운 궤도 흔들기 하에 샘플(덮음)을 4°C(냉장고 또는 냉장실)로 옮깁니다.
      참고: 1x BB: 0.5% Triton X-100이 보충된 2x BB와 1x PBS를 동일한 부피로 혼합합니다.
8. 조직 샘플을 1x PBS 용액에 3x 15분(또는 필요한 경우 그 이상) 동안 RT에서 부드럽게 흔들어 헹굽니다.
9. 2차 항체를 이용한 염색
   1. 1:2000 희석(1 μg/mL)으로 1x BB에 용해된 형광단 접합 2차 항체 조합 120-150mL를 적용합니다. 488 nm conjugated anti-rabbit secondary 항체, 568 nm anti-mouse secondary 항체, and 647 nm anti-goat secondary antibody를 적용한다.
   2. 그런 다음 RT에서 1.5-2시간 동안 부드러운 궤도 흔들림으로 샘플(덮음)을 배양합니다(또는 4°C에서 ON).
10. 조직 샘플을 1x PBS 용액에 3x 15분(또는 필요한 경우 그 이상) 동안 RT에서 부드럽게 흔들어 헹굽니다.
11. 현미해부 및 장착을 수행합니다.
    1. 해부 현미경으로 감각 전정 상피 주변의 과도한 조직과 막을 제거합니다. 70% 에탄올을 사용하여 유리 조직학 슬라이드의 표면을 청소하고 자연 건조한 다음 적절한 장착 매체를 55mL 방울 떨어뜨립니다.
    2. 감각 조직 샘플을 장착 매체로 옮깁니다. 가는 집게를 사용하여 s의 방향을 부드럽게 잡습니다.amp장착 매체에서 머리카락 다발 면이 위로 향하게 합니다.
    3. 샘플이 들어 있는 장착 매체에 적절한 크기의 커버 유리를 부드럽게 놓고 기포를 제한하려고 합니다. 커버 유리가 컨포칼 현미경 검사에 필요한 #1.5 두께 등급인지 확인합니다.
    4. 슬라이드를 어두운 곳(예: 벤치 서랍)에 놓아 장착 매체가 고정되도록 합니다. 투명 매니큐어를 사용하여 커버 유리를 슬라이드에 밀봉하고 컨포칼 현미경으로 검사하기 전에 어두운 곳에서 건조시킵니다. 그 후, 밀봉된 슬라이드를 이미징할 때까지 4°의 어두운 곳(슬라이드 폴더의 슬라이드 상자)에 보관합니다.
12. 488nm 및 657nm 채널의 40x-100x 배율에서 컨포칼 현미경을 사용하여 표본을 이미지화합니다.

결과

이 기술을 사용하여 인간의 난소와 측면 및 상관 앰풀라를 최소한의 외상으로 그대로 채취했습니다(그림 2). 그림 2에서 볼 수 있듯이, 팽대는 막관의 상당 부분을 사용하여 수확할 수 있습니다. anti-tenascin-C(세포외 기질 단백질) 및 anti-oncomodulin(파브알부민 단백질군의 작은 칼슘 결합 단백질)을 사용한 면역형광 표지는 제1형 전...

토론

이 논문은 내시경을 사용하여 BSS에서 전정 말단기를 수중에서 적출하는 새로운 기술과 면역형광 이미징을 사용한 분석에 대해 설명합니다. 여기에서는 성공적인 면역 표지를 위한 온전한 전정 유모 세포와 충분한 조직 품질을 가진 온전한 전정 말단 장기의 수확을 보여줍니다. 본 표본의 유모 세포 밀도는 살아있는 장기 기증자의 다른 연구에서 얻은 것과 유사했다

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Phosphate Buffered Saline Stock	Sigma-Aldrich	P5493
32% Paraformaldehyde Stock Solution	ThermoFisher Scientific	50-980-495
Alexa Fluor 488 Anti-Rabbit Secondary Antibody	Jackson Immunoresearch	111545144
Alexa Fluor 568 Anti-Mouse Secondary Antibody	Jackson Immunoresearch	115575146
Alexa Fluor 647 Anti-Goat Secondary Antibody	Jackson Immunoresearch	705607003
Balanced Salt Solution	ThermoFisher Scientific	14040117
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	10711454001
Confocal microscope	Nikon A1	A1
Cover glass (18 mm x 18 mm, thickness #1.5 )	Corning	2850-18
Endo-Scrub 2 Lens Cleaning Sheath	Medtronic	IPCES2SYSKIT
Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) Acid Solution	Sigma-Aldrich	E8008
Goat Anti-oncomodulin Antibody	R&D Systems	AF6345
Hopkins 0 Degree Telescope	Karl Storz
Mouse Anti-calretinin Antibody	BD Biosciences	610908
ProLong Gold antifade reagent	Invitrogen	P10144
Rabbit Anti-tenascin C Antibody	Millipore	AB19013
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5