肺線維症に伴う肺動脈性肺高血圧症のラットモデルの確立と検証

要約

ここでは、ブレオマイシンを気道に注入することにより、肺線維症に関連する肺動脈性肺高血圧症(PF-PH)ラットモデルを誘発する方法を紹介します。また、この動物モデルを検証するための段階的なアプローチも提供しています。

要約

肺線維症の患者は、予後不良の合併症である肺高血圧症を発症するリスクが高くなります。現在、このリンクのメカニズムはまだよく理解されていません。この分野での進歩に対する大きな障害は、PF-PHを再現するための信頼性の高い動物モデルがないことです。本研究は、安定したPF-PHラットモデルを確立することを目的とした。ラットは介入前に一晩絶食されました。ペントバルビタールナトリウム麻酔下 (45 mg/kg) で、PE50 チューブを 3 cm (声門からチューブまでの距離) の深さに挿入して気管に挿管しました。ブレオマイシン(BLM)は、単回投与(5 mg / kg、0.9%NaClの0.2 mLに溶解)として気管内投与されました。.注射後、ラットを直ちに回転させて、BLMが均一に分布するようにしました。BLM注射の35日後、ラットは進行性の肺機能障害を示し、右室収縮期血圧と右室肥大を上昇させ、肺高血圧症の病理学的特徴を明らかにしました。私たちは、PF-PHのラットモデルを確立するための一般的で信頼性の高い方法を提供します。

概要

間質性肺疾患(ILD)による肺高血圧症(PH)は臨床的に一般的であり、特発性肺線維症(IPF)患者の有病率は10%から80%と推定され、他の線維性ILDでも頻繁に見られます^1,2。多くの研究により、PHの発症は実質的な罹患率と生存率の低下に関連していることが示されています^3,4,5。グループ1の肺動脈性肺高血圧症(PAH)と比較して、肺線維症(PF-PH)に関連する肺動脈性肺高血圧症の病因は依然として十分に理解されていません⁶。ラットにおけるPF-PHの動物モデルを確立する目的は、肺高血圧症に関連する肺線維症に関する科学的研究に信頼性の高いフレームワークを提供し、臨床治療への応用の可能性を探ることです。

ブレオマイシンは、動物モデルで広く使用されている肺線維症の古典的な誘導物質です⁷。Blackburn et ^al.8 と当研究室⁹ によるさらなる研究により、ブレオマイシンは、右心室収縮期血圧 (RVSP) や右心室肥大など、肺高血圧症の典型的な病理学的特徴も引き起こすことが明らかになりました。メカニズム的には、ブレオマイシンは肺実質線維症、低酸素性血管収縮、および肺血管床密度の低下を誘発し、それによって肺高血圧症の発症につながります⁶。さらに、ブレオマイシン治療の7日目から肺血管内皮細胞の有意な喪失が観察され、この喪失^は実験9の過程で徐々に悪化しました。この現象は、ブレオマイシンが誘発する肺血管内皮機能障害が肺高血圧症の開始と進行に潜在的な役割を果たしている可能性を示唆しています。

IPF患者は肺間質性線維症により、長期間にわたって低酸素状態にあり、心肺血管に代償性変化が起こり、肺高血圧症を引き起こします⁶。動物モデルの使用は、肺高血圧症に関連するヒト特発性肺線維症の根底にあるメカニズムをさらに理解するのに役立ちます。このモデルは、ヒトの疾患の病理学的特徴を完全にシミュレートすることはできませんが、それでも貴重な洞察を提供することができます。ブレオマイシンの単回投与気道注入、形質転換成長因子のウイルスベクター送達、シリカ^への曝露など、肺線維症をシミュレートする多くの実験モデルがあります^8,10。現在、BLMモデルは、短時間で容易に誘導でき、再現性が高いため、最も広く使用され、特徴付けられたモデルです。さらに、肺線維症の時間的変化は、ブレオマイシンマウスモデルで評価されており、線維症マーカーおよびCol1A1およびCol1A2などの疾患病理に関連する遺伝子の発現の増加が15〜21日目に観察^{されました8。}右心室肥大や RVSP の有意な増加などの心血管系の変化は、33 日目以降に検出されました¹¹。同時に、当研究室では、ブレオマイシン⁹によって誘導されたラットモデルのPHおよびPFパラメータの変化を以前に評価してきました。ラットでは進行性肺機能障害やコラーゲン沈着などの肺線維症(PF)の特徴に加え、ブレオマイシンの単回気道点滴後7〜35日以内に肺高血圧症(PH)の典型的な特徴が徐々に現れることを見出しました。RVSPとフルトン指数は時間依存性の増加を示しました。現在、肺線維症のさまざまな動物が文献で報告されています。一部の専門家は、ラットモデルがマウスモデルよりも顕著な線維性反応を示したことを示唆しています¹²。したがって、肺線維症と肺高血圧症の進行をよりよく研究するためには、ブレオマイシン誘発ラットモデルが鍵となります。

プロトコル

本研究で報告した動物実験は、広州医科大学第一附属病院動物管理委員会(倫理承認番号:2018-456)によって承認されました。

1. 実験ラットの調達

1. ラットを正常対照群とモデル群の2つのグループに分け、各グループに7匹のラットを配置します。研究には、体重200±20gの10週齢の雄Sprague-Dawley(SD)ラットを使用してください

2. PF-PHラットモデルの誘導

1. 手順中の誤嚥の逆流を防ぐために、モデリングの前にラットを一晩絶食します。
2. ペントバルビタールナトリウム(45 mg / kg)の腹腔内注射によりラットに麻酔をかけ、処置の精度と安全性を確保し、動物の痛みとストレスを最小限に抑えます。つま先をつまむことに対する反応の欠如によって外科的麻酔レベルを確認します。同時に、乾燥を防ぐためにネズミの目に軟膏を塗ります。
3. PE50チューブを3cm(声門からチューブまでの距離)の深さに挿入してラットの気管を挿管します。.
4. 1 mLシリンジ(26 G)を使用して、0.2 mLのブレオマイシン(5 mg / kg、0.9%NaClの0.2 mLに溶解)を引き出します。.BLMを含むシリンジをカニューレを介して単回投与として気道に注入します。.対照群のラットには、滅菌生理食塩水(0.2 mL)の気管内投与を行います。.この過程で、ラットは痛み止めを必要としません。
5. ブレオマイシンが均一に分布するように、ラットを仰臥位に置き、静かに保持し、ゆっくりと回転させます。.推奨される回転角度は30°〜45°で、両側が交互になります。各回転は10〜15秒間維持し、3x〜4xを繰り返す必要があります。
6. ラットを温熱パッドの上に置いて、体温を維持し、状態を注意深く監視します。ラットが自分で動き始めるのを観察し、動物を加熱パッドから別のケージに移して回復させます。
7. BLM 注射の 5 週間後、ラットを評価して、心エコーモニタリング、血行動態測定、組織学的分析などの方法を使用して PF-PH モデルを成功裏に確立できるかどうかを判断します。

3. 心エコーモニタリング

1. 4%イソフルランを使用してラットに麻酔をかけます。ラットの毛皮を脱毛クリームで取り除き、胸部に超音波ジェルを塗ります。
2. ラットの右心臓の機能的および構造的パラメータを250MHzの超音波プローブで評価します。心室の最良の長軸ビューを取得するには、プローブを動物の胸部の中央線の左側に配置します。
3. 個々の解剖学的構造に従って、切歯が右肩を向くように、プローブを左胸骨線に対して反時計回りに15°回転させ、Bモードでx軸とy軸を調整して、心臓全体が視野の中心にくるようにします。
4. [色]を選択すると、肺動脈を区別するための血流の色が表示されます(この位置の肺動脈血流信号は青色です)。
5. PW(PWドップラー)モードを選択し、サンプリングラインを肺動脈弁の下に置き、PWアングルノブを回してサンプリングラインの向きを調整し、サンプリング方向が肺動脈の血流の方向と平行になるようにします(約25°)。もう一度PWキーを押すと、肺動脈血流加速時間/排出時間(PAT/PET)を取得できます。少なくとも5回の心周期を測定し、平均します。Cine を使用して画像を保存します。
6. 動物を低い頭と高い足に調整し、超音波プローブを動物の心臓の頂点に置き、心臓の頂点に沿って超音波を駆動して4室の切歯面を取得します。Bモードでx軸とy軸を調整して、4つの心腔が見えるようにします。
7. Mモードを押しながら測定線を2倍に表示し、三尖弁リングと右心室自由壁の接合部に配置します。三尖弁変位距離 (TAPSE) を少なくとも 3 心周期以内で測定し、Cine に保存します。
8. プローブを動物の胸の右鎖骨の正中線に置き、プローブと動物の胸のノッチとの間の角度を約45°に調整します。Bモードで画像を調整して、右心室と心室中隔が見えるようにします。
9. Mモードを選択して測定ラインを2x表示し、測定ラインを心室中隔の中央に配置します。サンプリングラインは、右心室自由壁に対して垂直でした。画像を保存して、右心室自由壁の厚さを取得します。

4. 肺機能の推定

1. PFTソフトウェアを開き、デバイスが認識されていることを確認します。機器の指示に従って校正し、流量センサーと圧力センサーの精度を確保します。PFTソフトウェアで、呼吸数、一回換気量、試験時間などの試験パラメータを設定します。
2. 動物検出モードは、ラット研究のモードです。メインコントロール機器のスイッチをオンにし、各信号のスイッチを確認します amplifierはオフの位置にあります。
3. 動物の体重に応じて気流を設定します。吸引気流調整ナットをオンにし、吸気を5に設定します。呼気調節ナットをオンにし、ゆっくりとした呼気を-4に設定します。圧力値を60 cm H₂Oに設定し、FRCフロー、フロー、ハイフロー、肺圧の順に従って、誤差が0.5%未満になるように装置を校正します。
4. ステップ2.2のように、ペントバルビタールナトリウム(45 mg / kg)による腹腔内注射によりラットに麻酔をかけます。.首の中央に沿って皮膚を切り取り、筋肉を層ごとに取り除きます。
5. 頸部気管の露出した上部で、気管軟骨リングの間に水平切開を行います。金属製のカニューレを気管切開部にすばやく挿入し、カニューレが正しく配置され、固定されていることを確認します。4-0シルク糸縫合糸を使用してカニューレを気管に固定し、カニューレが滑ったり外れたりするのを防ぎます。ラットをPFT動物コンパートメントに置き、気管カニューレを器具の外側の気流チャネルインターフェースに接続します。
6. [スタート] ボタンをクリックして、強制肺活量 (FVC) と動的肺コンプライアンスを調べます。データの一貫性を確保するには、各インジケーターを少なくとも 3 回記録します。
7. テストが完了すると、データは保存され、分析ソフトウェアにエクスポートされます。統計ソフトウェアを使用してデータを分析し、異なるグループの肺機能パラメータを比較します。

5. 血行動態・組織学的測定

1. 右心室収縮期血圧(RVSP)の検出
   1. ステップ2.2のように、ペントバルビタールナトリウム(45 mg / kg)による腹腔内注射によりラットに麻酔をかけます。.ネズミが反応しないことを確認するためにつま先をつまんで、ネズミが適切に麻酔をかけられていることを確認してください。実験台でラットの腹部を上向きに固定し、乾燥を防ぐためにラットの目にアイクリームを塗ります。
   2. 手術用ハサミで首の右側を切開(約4cm)し、顕微鉗子で外頸静脈を分離します。マイクロ鉗子で約1cmの長さの静脈をやさしく分離し、遠位端と近位端に2本の手術用ラインを挿入します。
   3. 挿管する前に、PE50チューブを1%ヘパリンナトリウムまたはEDTAを含む生理食塩水に少なくとも30分間浸します。.生理学的レコーダーを調整して圧力を0ラインに戻し、圧力範囲を0〜150mmHgに調整します。
   4. 外頸静脈の遠位端を4-0絹糸で結紮し、近位手術ラインをそっと持ち上げて、遠位静脈壁に置きます。小さなハサミを使って小さな切開(約0.3mm)をします。PE50チューブを外頸静脈に挿入した後、4-0シルク糸を使用してカテーテルを外頸静脈と一緒に結紮し、血液漏れを防ぎます。
   5. レコーダーで静脈圧波形を観察します。カテーテルをゆっくりと右心房に押し込むと、右心房の波形が約0〜5mmHgの振幅で見えます。カテーテルが右心房から右心室へと進み続けると、右心室圧波形が見えるようになります。圧力が安定したら、RVPを5分間記録し、データを保存して分析ソフトウェアで分析します。
2. フルトン指数の検出
   1. RVSPの検出後、イソフルラン麻酔(5%、2 L / min O₂)後、放血によりラットを安楽死させます。
   2. 開胸術後、ピンセットでラットの無傷の心臓を取り除きます。心臓の近くの耳介と結合組織をハサミで切り取ります。
   3. 肺動脈に沿って右心室の自由壁を切断します。この組織が右心室(RV)です。残りの組織は、左心室と心室中隔(LV + S)です。分離後、右心室(RV)と左心室と心室間中隔(LV+S)の表面を濾紙で排出し、分析天秤を使用して別々に計量します。右心室(RV)と左心室と心室中隔(LV+S)の重量を記録した後、右心室と左心室と心室中隔の重量比(RV/(LV+S))を計算します。
3. 組織学的染色
   1. 胸腔を開いた後、10mLの注射器を使用して3mLの生理食塩水を採取します。シリンジを肺動脈に挿入し、生理食塩水をゆっくりと注入して肺を洗い流し、血液やその他の残留物を取り除きます。
   2. はさみを使用して、肺の右副葉と右前葉を解剖します。これらの2つの肺葉を4%ホルマリンに入れて固定し、組織の形態と構造を維持します。肺の残りの3つの葉(左肺、右中葉、右後葉など)を液体窒素にすばやく入れて凍結保存し、その後の実験に備えます。
   3. 肺組織の表面から余分な脂肪と結合組織を取り除き、組織ブロックが清潔できちんとしていることを確認します。肺葉を5 mm x 5 mm x 3 mmの小さなブロックにトリミングします。トリミングした組織ブロックを脱水機に入れ、一連のアルコール(60%、70%、80%、90%、100%)を使用して徐々に脱水します。
   4. 肺組織をキシレンに2時間浸して透明にします。取り出し後、溶かしたパラフィンに56〜58°Cで2時間浸し、完全に浸透させます。次に、組織を型に入れ、切断面を下に向けて配置し、その後の切片化を行います。
   5. ミクロトーム上のワックスブロックを4〜8μmの厚さでスライスします¹³、病理学的染色のために室温で保存します。
   6. EosinとMassonのトリクローム染色^{を行う 14}.

6. ヒドロキシプロリン(HYP)の検出

1. ガラス管内の肺組織30〜100mgを秤量します。2mLの塩酸溶液(6mol/L)を加え、大きな塊が見えなくなるまでオーブンで110°Cで2〜6時間消化します。
2. 冷却後、1 mLのNaOH溶液(10 mol / L)を使用してpH値を6〜8の範囲に調整し、蒸留水を4 mL溶液に凝縮します。最後に、28,620 x g で25°Cで20分間遠心分離し、上清を取ります。
3. マイクロプレートリーダーを30分間予熱し、波長を560nmに調整し、蒸留水を使用して装置をゼロにします。
4. 標準溶液を蒸留水で希釈して、30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、および0.234μg/mLの濃度の標準溶液を調製します。
5. サンプル上清60μLを取捨離し、試薬A60μLと混合し、室温で20分間放置します。
6. 試薬B60μLと蒸留水120μLを加えます。混合溶液を60°Cのウォーターバスに20分間置きます。標準溶液の各濃度(例:30、15、7.5、3.75、1.875、0.938、0.469、0.234 μg/mL)について同じ手順に従い、それに応じて操作を実行します。
7. 室温で15分間静置した後、溶液200 μLを96ウェルプレートに取り、560 nmの光吸収値を検出します。標準溶液の濃度をx軸、測定値をy軸として標準曲線をプロットし、方程式y = kx + bを求めます。サンプルの測定値を方程式に代入して、サンプルの濃度を決定します。

結果

ラットにおけるブレオマイシン誘発性肺線維症
ブレオマイシンは、^{動物モデル7}における肺線維症の古典的な誘導物質として報告されています。ここでは、BLM刺激後の肺線維症の指標が評価されました。まず、BLM治療の35日後、肺機能検査を実施し、モデル群のFVC(図1E)と動的肺コンプライアンス(?...

ディスカッション

特発性肺線維症は進行性の致命的な疾患であり、診断から生存期間の中央値は2〜3年であり、予後が暗いことを示唆しています⁹。肺高血圧症はIPFの一般的な併存疾患であり、IPFを急速に悪化させ、予後を悪化させます¹⁵。さらに、IPF-PH⁷の治療選択肢は限られていました。したがって、PF-PHの根底にある分子メカニ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleomycin	MedChemExpress	HY-17565A
Coupling agent	HYNAUT	BX-CSRH
Formalin fixative	Biosharp)	BL401B
Hair removal cream	LUSEN	LS-B-TMG-50
Hematoxylin eosin (HE) staining kit	Beyotime	C0189S
Isoflurane	RWD Life Science(China)	R510-22-10
Masson Tri-color dyeing kit	Beyotime	C0189S
Normal saline	KERONG	SLYS-001
syringe	Beyotime	FS701-50pcs