Создание и валидация модели легочной артериальной гипертензии, ассоциированной с фиброзом легких на крысах

Резюме

Здесь представлен метод индуцирования легочной артериальной гипертензии, ассоциированной с легочным фиброзом (PF-PH) на модели крыс, путем введения блеомицина в дыхательные пути. Мы также предлагаем пошаговый подход к валидации этой животной модели.

Аннотация

Пациенты с легочным фиброзом подвергаются более высокому риску развития легочной гипертензии, осложнения с плохим прогнозом. В настоящее время механизм этой связи все еще плохо изучен. Основным препятствием на пути прогресса в этой области является отсутствие надежной животной модели для репликации PF-PH. Целью данного исследования было создание стабильной модели PF-PH крыс. Крыс голодали в течение ночи перед вмешательством. Под натриевой пентобарбитальной анестезией (45 мг/кг) трахею интубировали с помощью трубки PE50, вставленной на глубину 3 см (расстояние от голосовой щели до трубки). Блеомицин (BLM) вводили внутритрахеально в виде однократной дозы (5 мг/кг, растворенных в 0,2 мл 0,9% NaCl). После инъекции крысы были немедленно повернуты, чтобы обеспечить равномерное распределение BLM. Через 35 дней после введения BLM у крыс наблюдалось прогрессирующее нарушение функции легких и повышение систолического давления в правом желудочке и гипертрофия правого желудочка, что выявило патологические особенности легочной гипертензии. Мы предлагаем общий и надежный метод создания модели PF-PH на крысах.

Введение

Легочная гипертензия (ЛГ), обусловленная интерстициальным заболеванием легких (ИЗЛ), является распространенным клиническим явлением, с предполагаемой распространенностью от 10% до 80% у пациентов с идиопатическим легочным фиброзом (ИЛФ), а также часто наблюдается при других фиброзных ИЗЛ ^1,2. Многочисленные исследования показали, что развитие ЛГ связано со значительной заболеваемостью и снижением выживаемости ^3,4,5. По сравнению с легочной артериальной гипертензией (ЛАГ) 1-й группы патогенез легочной артериальной гипертензии, ассоциированной с фиброзом легких (ЛП-ЛГ), остается плохо изученным⁶. Целью создания животной модели ЛП-ПГ у крыс является обеспечение надежной основы для научных исследований легочного фиброза, связанного с легочной гипертензией, и изучение потенциальных путей клинического терапевтического применения.

Блеомицин является классическим индуктором легочного фиброза, широко используемым на животных моделях⁷. Дальнейшие исследования Blackburn et ^al.8 и нашей лаборатории⁹ показали, что блеомицин также может вызывать типичные патологические признаки легочной гипертензии, такие как повышенное систолическое давление правого желудочка (ПВЛ) и гипертрофия правого желудочка. Механически блеомицин вызывает фиброз легочной паренхимы, гипоксическую вазоконстрикцию и снижение плотности легочного сосудистого русла, тем самым приводя к развитию легочной гипертензии⁶. Кроме того, мы наблюдали значительную потерю эндотелиальных клеток легочных сосудов, начиная с 7-го дня лечения блеомицином, причем эта потеря постепенно ухудшалась в течение эксперимента⁹. Это явление позволяет предположить, что индуцированная блеомицином эндотелиальная дисфункция легочных сосудов может играть потенциальную роль в инициации и прогрессировании легочной гипертензии.

Из-за интерстициального фиброза легочной артерии пациенты с ИЛФ длительное время находятся в состоянии гипоксии, а в сердечно-легочных сосудах происходят компенсаторные изменения, что приводит к легочной гипертензии⁶. Использование животных моделей может помочь нам лучше понять основные механизмы идиопатического легочного фиброза человека, связанного с легочной гипертензией. Хотя эта модель не может полностью смоделировать патологические особенности заболевания человека, она все же может дать ценную информацию. Существует множество экспериментальных моделей, имитирующих легочный фиброз, таких как однократная инфузия блеомицина через дыхательные пути, доставка вирусного вектора трансформирующих факторов роста и воздействие диоксида кремния ^8,10. В настоящее время модель BLM является наиболее широко используемой и характеризуемой моделью, поскольку она легко наводится за короткое время и обладает высокой воспроизводимостью. Кроме того, временные изменения легочного фиброза были оценены на мышиной модели блеомицина, где повышенная экспрессия маркеров фиброза и генов, связанных с патологией заболевания, таких как Col1A1 и Col1A2, наблюдалась с 15-21 дня⁸. Сердечно-сосудистые изменения, такие как гипертрофия правого желудочка и значительное увеличение ПБВЛ, были обнаружены на^33-11 день или позже. В то же время наша лаборатория ранее оценивала изменения параметров PH и PF моделей крыс, индуцированные блеомицином⁹. Мы обнаружили, что в дополнение к таким характеристикам легочного фиброза (ЛП), как прогрессирующее нарушение функции легких и отложение коллагена у крыс, типичные признаки легочной гипертензии (ЛГ) постепенно проявлялись в течение 7–35 дней после однократной инстилляции блеомицина в дыхательных путях. RVSP и индекс Фултона показали рост зависимости от времени. В настоящее время в литературе сообщается о различных животных с легочным фиброзом. Некоторые эксперты предположили, что модели крыс демонстрировали более выраженную фиброзную реакцию,^{чем модели} мышей. Таким образом, для лучшего изучения прогрессирования легочного фиброза в сочетании с легочной гипертензией, модель крыс, индуцированной блеомицином, является ключевой.

протокол

Эксперименты на животных, описанные в этом исследовании, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Первой аффилированной больницы Медицинского университета Гуанчжоу (номер этического одобрения: 2018-456).

1. Закупка подопытных крыс

1. Разделите крыс на две группы: нормальную контрольную группу и модельную группу, по 7 крыс в каждой группе. Для исследования используйте 10-недельных самцов крыс породы Спрэг-Доули (SD) массой от 200 ± 20 г

2. Индукция модели крысы PF-PH

1. Чтобы предотвратить срыгивание аспирации во время процедуры, голодайте на крысах в течение ночи перед моделированием.
2. Обезболивайте крыс путем внутрибрюшинного введения пентобарбитала натрия (45 мг/кг) для обеспечения точности процедуры и безопасности, а также минимизации боли и стресса у животных. Подтвердите уровень хирургической анестезии по отсутствию реакции на защемление пальца ноги. В то же время нанесите мазь на глаза крыс, чтобы предотвратить сухость.
3. Интубируйте трахею крысы с помощью трубки PE50, вставленной на глубину 3 см (расстояние от голосовой щели до трубки).
4. С помощью шприца объемом 1 мл (26G) наберите 0,2 мл Блеомицина (5 мг/кг, растворенного в 0,2 мл 0,9% NaCl). Введите шприц, содержащий BLM, в дыхательные пути через канюлю в качестве однократной дозы. Крысам контрольной группы проводят внутритрахеальное введение стерильного физиологического раствора (0,2 мл). Во время этого процесса крысы не нуждаются в обезболивании.
5. Чтобы обеспечить равномерное распределение блеомицина, поместите крысу в положение лежа на спине, осторожно держите и медленно вращайте. Рекомендуемый угол поворота составляет 30°-45°, чередуясь между сторонами. Каждый оборот следует выдерживать в течение 10-15 с, повторять 3х-4х.
6. Размещайте крыс на грелках, чтобы поддерживать температуру тела, и внимательно следите за их состоянием. Наблюдайте, когда крысы начинают самостоятельно передвигаться и перекладывайте животных из грелки в отдельную клетку для восстановления.
7. После 5 недель инъекции BLM оцените крыс, чтобы определить, можно ли успешно установить модель PF-PH с использованием таких методов, как эхокардиографический мониторинг, гемодинамические измерения и гистологический анализ.

3. Эхокардиографическое мониторирование

1. Обезболивайте крыс с помощью 4% изофлурана. Снимите шерсть крысы с помощью крема для эпиляции и нанесите ультразвуковой гель на ее грудь.
2. Оцените функциональные и структурные параметры правых отделов сердца у крыс с помощью ультразвукового датчика с частотой 250 МГц. Чтобы получить наилучший вид желудочка по длинной оси, поместите зонд с левой стороны срединной линии грудной клетки животного.
3. В зависимости от индивидуальной анатомии, поверните зонд на 15° против часовой стрелки относительно левой парастернальной линии, так, чтобы резец был направлен к его правому плечу, и отрегулируйте оси x и y в B-режиме так, чтобы все сердце находилось в центре поля зрения.
4. Выберите Цвет, чтобы отобразить цвет кровотока для различения легочной артерии (сигнал кровотока легочной артерии в этом положении синий).
5. Выберите режим PW (PW Doppler), поместите линию отбора проб под легочный клапан и поверните ручку угла PW, чтобы отрегулировать направление линии отбора проб таким образом, чтобы направление отбора проб было параллельно направлению кровотока в легочной артерии (около 25°). Нажмите клавишу PW еще раз и узнайте время ускорения кровотока в легочной артерии/время выброса (PAT/PET). Измеряйте не менее пяти сердечных циклов и в среднем. Используйте функцию Cine для сохранения изображения.
6. Отрегулируйте животное до низкой головы и высокой ноги, поместите ультразвуковой зонд на вершину сердца животного и проведите ультразвук вдоль верхушки сердца, чтобы получить четырехкамерную резцовую поверхность. Отрегулируйте оси x и y в режиме B, чтобы убедиться, что четыре камеры сердца видны.
7. Отобразите линию измерения 2 раза, удерживая режим M, и поместите ее на стыке кольца трикуспидального клапана и свободной стенки правого желудочка. Измерьте расстояние смещения трикуспидального клапана (TAPSE) в течение как минимум трех сердечных циклов и сохраните его в Cine.
8. Поместите зонд на среднюю линию правой ключицы грудной клетки животного и отрегулируйте угол между зондом и выемкой на грудной клетке животного примерно до 45°. Настройте изображение в B-режиме так, чтобы был виден правый желудочек и межжелудочковая перегородка.
9. Выберите M-Mode для отображения измерительной линии 2x и поместите измерительную линию в середину межжелудочковой перегородки. Линия отбора проб была перпендикулярна свободной стенке правого желудочка. Сохраните изображение, чтобы получить толщину свободной стенки правого желудочка.

4. Оценка функции легких

1. Откройте программное обеспечение PFT и убедитесь, что устройство распознано. Выполните калибровку в соответствии с инструкциями по оборудованию, чтобы обеспечить точность датчиков расхода и давления. Установите параметры теста в программном обеспечении PFT, такие как частота дыхания, дыхательный объем, продолжительность теста и т. д.
2. Режим обнаружения животных — это режим для исследований на крысах. Включите переключатель основного прибора управления и убедитесь, что переключатель каждого усилителя сигнала находится в выключенном положении.
3. Установите воздушный поток в соответствии с весом тела животного. Включите гайку регулировки всасывающего потока воздуха и установите вдох в положение 5. Включите гайку регулировки потока воздуха на выдохе и установите медленное выдох на -4. Установите значение давления на 60 см H₂O и затем откалибруйте прибор в соответствии с порядком расхода FRC, потока, высокого потока и давления в легких с погрешностью менее 0,5%.
4. Обезболивают крыс путем внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала натрия (45 мг/кг), как показано на шаге 2.2. Разрежьте кожу по центру шеи и снимайте мышцы слой за слоем.
5. На обнаженной верхней части шейной трахеи сделайте горизонтальный разрез между кольцами хряща трахеи. Быстро вставьте металлическую канюлю в разрез трахеи, убедившись, что канюля правильно расположена и надежно закреплена. Используйте швы из шелковой нити 4-0, чтобы зафиксировать канюлю к трахее, предотвращая ее соскальзывание или смещение. Поместите крысу в отсек для животных PFT и подключите трахеальную канюлю к интерфейсу канала воздушного потока снаружи инструмента.
6. Нажмите кнопку « Пуск » и проверьте форсированную жизненную емкость легких (ФЖЕЛ) и динамическую податливость легких. Чтобы обеспечить согласованность данных, записывайте каждый показатель не менее 3 раз.
7. После завершения испытания данные сохраняются и экспортируются в аналитическое программное обеспечение. Используйте статистическое программное обеспечение для анализа данных и сравнения параметров функции легких разных групп.

5. Гемодинамические и гистологические измерения

1. Определение систолического давления в правом желудочке (СЗНР)
   1. Обезболивают крыс путем внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала натрия (45 мг/кг), как показано на шаге 2.2. Убедитесь, что крыса была должным образом обезболивана, ущипнув палец ноги, чтобы крыса не реагировала. Зафиксируйте брюшную полость крысы вверх на экспериментальном стенде и нанесите крем для глаз крысы для предотвращения сухости.
   2. Сделайте разрез (около 4 см) с правой стороны шеи с помощью хирургических ножниц и отделите наружную яремную вену с помощью микрохирургических щипцов. Аккуратно отделите вены длиной около 1 см с помощью микрощипцов и введите две хирургические линии на дистальном и проксимальном концах.
   3. Перед интубацией замочите трубку PE50 в обычном физрастворе, содержащем 1% гепарина натрия или ЭДТА, не менее чем на 30 минут. Отрегулируйте физиологический регистратор, чтобы вернуть давление к линии 0, и отрегулируйте диапазон давления до 0-150 мм рт.ст.
   4. Перевязать дистальный конец наружной яремной вены шелковой нитью 4-0, аккуратно приподнять проксимальную операционную линию и поместить ее на дистальную стенку вены. С помощью маленьких ножниц сделайте небольшой надрез (около 0,3 мм). После введения трубки PE50 в наружную яремную вену используйте шелковую нить 4-0 для перевязки катетера вместе с наружной яремной веной, чтобы предотвратить утечку крови.
   5. Следите за формой волны венозного давления на регистраторе. Медленно введите катетер в правое предсердие, и форма волны правого предсердия станет видимой с амплитудой около 0-5 мм рт.ст. После того, как катетер продолжает продвигаться из правого предсердия в правый желудочек, можно увидеть форму волны давления в правом желудочке. Когда давление стабилизируется, запишите RVP в течение 5 минут, и данные будут сохранены и проанализированы с помощью аналитического программного обеспечения.
2. Определение индекса Фултона
   1. После обнаружения РВСП, после анестезии изофлураном (5%, 2 л/мин О₂), усыпить крыс путем обескровливания.
   2. После торакотомии удалите неповрежденное сердце крысы с помощью пинцета. Отрежьте ножницами ушную раковину и соединительную ткань возле сердца.
   3. Разрежьте свободную стенку правого желудочка вдоль легочной артерии. Этой тканью является правый желудочек (ПЖ). Остальные ткани представляют собой левый желудочек плюс межжелудочковая перегородка (LV+S). После отделения слейте воду с поверхности правого желудочка (ПЖ) и левого желудочка плюс межжелудочковой перегородки (ЛЖ+С) с помощью фильтровальной бумаги и взвесьте отдельно с помощью аналитических весов. После регистрации веса правого желудочка (ПЖ) и левого желудочка плюс межжелудочковой перегородки (ЛЖ+С) рассчитайте отношение массы правого желудочка к левому желудочку плюс межжелудочковая перегородка (ПЖ/(ЛЖ+С)).
3. Гистологическое окрашивание
   1. После вскрытия грудной полости с помощью шприца объемом 10 мл наберите 3 мл физиологического раствора. Введите шприц в легочную артерию и медленно вводите физиологический раствор, чтобы промыть легкие, удаляя кровь и другие остатки.
   2. С помощью ножниц рассеките правую добавочную долю и правую переднюю долю легкого. Поместите эти две доли легких в 4% формалин для фиксации, чтобы сохранить морфологию и структуру ткани. Быстро поместите оставшиеся три доли легкого (такие как левое легкое, правую среднюю долю и правую заднюю долю) в жидкий азот для хранения в замороженном виде, чтобы подготовить его к последующим экспериментам.
   3. Удалите излишки жира и соединительной ткани с поверхности легочной ткани, чтобы тканевые блоки были чистыми и аккуратными. Обрежьте доли легких на небольшие блоки размером 5 мм х 5 мм х 3 мм. Поместите обрезанные тканевые блоки в дегидратор и постепенно обезвоживайте их с помощью градиентного ряда спирта (60%, 70%, 80%, 90%, 100%).
   4. Погрузите легочную ткань в ксилол на 2 ч для достижения прозрачности. После извлечения замочите его в расплавленном парафине при температуре 56-58 °C на 2 часа, чтобы обеспечить полную инфильтрацию. Затем поместите ткань в форму, расположив ее режущей поверхностью вниз для последующего разрезания.
   5. Нарежьте восковой блок на микротоме толщиной 4-8 мкм¹³, и храните его при комнатной температуре для патологического окрашивания.
   6. Выполните трихромное окрашивание по Эозину и Массону¹⁴.

6. Определение гидроксипролина (HYP)

1. Взвесьте 30-100 мг легочной ткани в стеклянной пробирке. Добавьте 2 мл раствора соляной кислоты (6 моль/л) и варите при 110 °C в духовке в течение 2-6 часов, пока не исчезнут большие комки.
2. После охлаждения отрегулируйте значение pH в диапазоне 6-8, используя 1 мл раствора NaOH (10 моль/л), затем сконденсируйте дистиллированную воду до 4 мл раствора. Наконец, центрифугируйте при 28 620 x g при 25 °C в течение 20 мин и принимайте надосадочную жидкость.
3. Нагрейте считыватель микропланшетов в течение 30 минут, отрегулируйте длину волны до 560 нм и обнулите прибор с помощью дистиллированной воды.
4. Стандартный раствор разбавляют дистиллированной водой для получения стандартных растворов с концентрациями 30, 15, 7,5, 3,75, 1,875, 0,938, 0,469 и 0,234 мкг/мл.
5. Возьмите 60 мкл надосадочной жидкости образца и смешайте ее с 60 мкл реагента А, затем дайте постоять при комнатной температуре в течение 20 минут.
6. Добавьте 60 мкл реагента В и 120 мкл дистиллированной воды. Поместите смешанный раствор на водяную баню при температуре 60 °C на 20 минут. Выполните те же действия для каждой концентрации стандартных растворов (например, 30, 15, 7,5, 3,75, 1,875, 0,938, 0,469, 0,234 мкг/мл) и выполните соответствующие операции.
7. После выдерживания при комнатной температуре в течение 15 минут возьмите 200 мкл раствора в 96-луночном планшете, чтобы определить значение поглощения света на длине волны 560 нм. Построим стандартную кривую с концентрацией стандартных решений по оси x и измеренными значениями по оси y, получив уравнение y=kx+b. Подставьте измеренное значение образца в уравнение, чтобы определить концентрацию образца.

Результаты

Вызванный блеомицином фиброз легких у крыс
Сообщалось, что блеомицин является классическим индуктором фиброза легких на животных моделях⁷. Здесь оценивали индексы легочного фиброза после стимуляции BLM. Во-первых, после 35 дней лечения BLM мы пров...

Обсуждение

Идиопатический легочный фиброз является прогрессирующим, смертельным заболеванием со средней выживаемостью 2-3 года с момента постановки диагноза, что предполагает мрачный прогноз⁹. Легочная гипертензия является распространенным сопутствующим заболев...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleomycin	MedChemExpress	HY-17565A
Coupling agent	HYNAUT	BX-CSRH
Formalin fixative	Biosharp)	BL401B
Hair removal cream	LUSEN	LS-B-TMG-50
Hematoxylin eosin (HE) staining kit	Beyotime	C0189S
Isoflurane	RWD Life Science(China)	R510-22-10
Masson Tri-color dyeing kit	Beyotime	C0189S
Normal saline	KERONG	SLYS-001
syringe	Beyotime	FS701-50pcs