Estabelecimento e Validação de um Modelo de Rato de Hipertensão Arterial Pulmonar Associada à Fibrose Pulmonar

Resumo

Aqui, é introduzido o método de indução de hipertensão arterial pulmonar associada à fibrose pulmonar (FP-HP) modelo de rato por meio da injeção de bleomicina nas vias aéreas. Também fornecemos uma abordagem passo a passo para validar esse modelo animal.

Resumo

Pacientes com fibrose pulmonar apresentam maior risco de desenvolver hipertensão pulmonar, uma complicação com prognóstico desfavorável. Atualmente, o mecanismo dessa ligação ainda é pouco compreendido. Um grande obstáculo ao progresso nesta área é a falta de um modelo animal confiável para replicar o PF-PH. Este estudo teve como objetivo estabelecer um modelo estável de PF-PH em ratos. Os ratos foram colocados em jejum durante a noite antes da intervenção. Sob anestesia com pentobarbital sódico (45 mg/kg), a traqueia foi intubada com um tubo PE50 inserido a uma profundidade de 3 cm (distância da glote ao tubo). A bleomicina (BLM) foi administrada por via intratraqueal em dose única (5 mg/kg, dissolvida em 0,2 mL de NaCl a 0,9%). Após a injeção, os ratos foram imediatamente girados para garantir uma distribuição uniforme do BLM. Aos 35 dias após a injeção de BLM, os ratos apresentaram comprometimento progressivo da função pulmonar e aumento da pressão sistólica do ventrículo direito e hipertrofia do ventrículo direito, revelando as características patológicas da hipertensão pulmonar. Fornecemos um método geral e confiável para estabelecer um modelo de PF-PH em ratos.

Introdução

A hipertensão pulmonar (HP) por doença pulmonar intersticial (DPI) é comum clinicamente, com prevalência estimada de 10% a 80% em pacientes com fibrose pulmonar idiopática (FPI), e também é freqüentemente observada em outras DPIs fibróticas ^1,2. Numerosos estudos têm demonstrado que o desenvolvimento da HP está ligado a morbidade substancial e redução da sobrevida ^3,4,5. Em comparação com a hipertensão arterial pulmonar (HAP) do Grupo 1, a patogênese da hipertensão arterial pulmonar associada à fibrose pulmonar (HP-FP) permanece pouco compreendida⁶. O objetivo de estabelecer um modelo animal de PF-PH em ratos é fornecer uma estrutura confiável para pesquisas científicas sobre fibrose pulmonar associada à hipertensão pulmonar e explorar possíveis caminhos para aplicações terapêuticas clínicas.

A bleomicina é um indutor clássico de fibrose pulmonar amplamente utilizado em modelos animais⁷. Outras pesquisas de Blackburn et ^al.8 e nosso^{laboratório9} revelaram que a bleomicina também pode desencadear características patológicas típicas da hipertensão pulmonar, como aumento da pressão sistólica do ventrículo direito (PSVD) e hipertrofia do ventrículo direito. Mecanicamente, a bleomicina induz fibrose parenquimatosa pulmonar, vasoconstrição hipóxica e redução da densidade do leito vascular pulmonar, levando ao desenvolvimento de hipertensão pulmonar⁶. Além disso, observamos uma perda significativa de células endoteliais vasculares pulmonares a partir do 7º dia de tratamento com bleomicina, com essa perda piorando progressivamente ao longo do experimento⁹. Esse fenômeno sugere que a disfunção endotelial vascular pulmonar induzida por bleomicina pode desempenhar um papel potencial no início e progressão da hipertensão pulmonar.

Devido à fibrose intersticial pulmonar, os pacientes com FPI ficam em estado de hipóxia por muito tempo, e ocorrem alterações compensatórias nos vasos cardiopulmonares, o que leva à hipertensão pulmonar⁶. O uso de modelos animais pode nos ajudar a entender melhor os mecanismos subjacentes da fibrose pulmonar idiopática humana associada à hipertensão pulmonar. Embora este modelo não possa simular totalmente as características patológicas da doença humana, este modelo ainda pode fornecer informações valiosas. Existem muitos modelos experimentais que simulam fibrose pulmonar, como infusão de bleomicina em dose única nas vias aéreas, liberação de vetor viral de fatores de crescimento transformadores e exposição à sílica ^8,10. Atualmente, o modelo BLM é o modelo mais utilizado e caracterizado, pois pode ser facilmente induzido em pouco tempo e possui alta reprodutibilidade. Além disso, alterações temporais na fibrose pulmonar foram avaliadas em um modelo de camundongo com bleomicina, onde o aumento da expressão de marcadores de fibrose e genes associados à patologia da doença, como Col1A1 e Col1A2, foram observados dos dias 15-21⁸. Alterações cardiovasculares, como hipertrofia ventricular direita e aumento significativo da PSVD, foram detectadas no dia 33 ou após^{o dia 11}. Ao mesmo tempo, nosso laboratório avaliou anteriormente as alterações nos parâmetros de PH e PF de modelos de ratos induzidos por bleomicina⁹. Descobrimos que, além das características da fibrose pulmonar (FP), como comprometimento progressivo da função pulmonar e deposição de colágeno em ratos, as características típicas da hipertensão pulmonar (HP) surgiram gradualmente dentro de 7 a 35 dias após uma única instilação de bleomicina nas vias aéreas. RVSP e índice de Fulton mostraram um aumento na dependência do tempo. Atualmente, vários animais com fibrose pulmonar têm sido relatados na literatura. Alguns especialistas sugeriram que os modelos de ratos exibiram uma resposta fibrótica mais pronunciada do que os modelos de camundongos¹². Portanto, para melhor estudar a progressão da fibrose pulmonar combinada com hipertensão pulmonar, um modelo de rato induzido por bleomicina é a chave.

Protocolo

Os experimentos com animais descritos neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Guangzhou (número de aprovação ética: 2018-456).

1. Aquisição de ratos experimentais

1. Divida os ratos em dois grupos: o grupo de controle normal e o grupo modelo, com 7 ratos em cada grupo. Utilizar ratos Sprague-Dawley (SD) machos com 10 semanas de idade com um peso de 200 ± 20 g para o estudo

2. Indução do modelo de rato PF-PH

1. Para evitar aspirações regurgitantes durante o procedimento, jejue os ratos durante a noite antes da modelagem.
2. Anestesiar ratos por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (45 mg/kg) para garantir a precisão e segurança do procedimento e minimizar a dor e o estresse do animal. Confirme os níveis de anestesia cirúrgica por falta de resposta ao beliscão do dedo do pé. Ao mesmo tempo, aplique uma pomada nos olhos dos ratos para evitar o ressecamento.
3. Intubar a traqueia do rato com um tubo PE50 inserido a uma profundidade de 3 cm (a distância da glote ao tubo).
4. Usando uma seringa de 1 mL (26G), retire 0,2 mL de bleomicina (5 mg / kg, dissolvido em 0,2 mL de NaCl a 0,9%). Injete a seringa contendo BLM nas vias aéreas através de uma cânula em dose única. Para ratos do grupo controle, execute a administração intratraqueal de solução salina normal estéril (0,2 mL). Durante esse processo, os ratos não precisam de alívio da dor.
5. Para garantir uma distribuição uniforme da bleomicina, coloque o rato em decúbito dorsal, segure suavemente e gire lentamente. O ângulo de rotação recomendado é de 30°-45°, alternando entre os lados. Cada rotação deve ser mantida por 10-15 s, repetida 3x-4x.
6. Coloque os ratos em almofadas de aquecimento para ajudar a manter a temperatura corporal e monitorar de perto seu status. Observe quando os ratos começam a se mover por conta própria e transfira os animais da almofada de aquecimento para uma gaiola separada para recuperação.
7. Após 5 semanas de injeção de BLM, avalie os ratos para determinar se o modelo PF-PH pode ser estabelecido com sucesso usando métodos como monitoramento ecocardiográfico, medições hemodinâmicas e análise histológica.

3. Monitorização ecocardiográfica

1. Anestesiar ratos com isoflurano a 4%. Remova o pelo do rato com um creme depilatório e aplique gel ultrassônico no peito.
2. Avaliar os parâmetros funcionais e estruturais do coração direito em ratos com sonda ultrassônica de 250 MHz. Para obter a melhor visão do ventrículo no eixo longo, coloque a sonda no lado esquerdo da linha mediana do peito do animal.
3. De acordo com a anatomia individual, gire a sonda 15° no sentido anti-horário em relação à linha paraesternal esquerda, com o incisivo apontando para o ombro direito, e ajuste os eixos x e y no modo B para que todo o coração fique no centro do campo visual.
4. Selecione Cor para exibir a cor do fluxo sanguíneo para distinguir a artéria pulmonar (o sinal do fluxo sanguíneo da artéria pulmonar nesta posição é azul).
5. Selecione o modo PW (PW Doppler), coloque o sample linha sob a válvula pulmonar e gire o botão de ângulo PW para ajustar a direção do sample linha de modo que o sample direção seja paralela à direção do fluxo sanguíneo da artéria pulmonar (cerca de 25°). Pressione a tecla PW novamente e obtenha o tempo de aceleração do fluxo sanguíneo da artéria pulmonar/tempo de ejeção (PAT/PET). Meça pelo menos cinco ciclos cardíacos e a média. Use o Cine para salvar a imagem.
6. Ajuste o animal para uma cabeça baixa e um pé alto, coloque a sonda ultrassônica no ápice do coração do animal e conduza o ultrassom ao longo do ápice do coração para obter a superfície incisal de quatro câmaras. Ajuste os eixos x e y no modo B para garantir que as quatro câmaras cardíacas estejam visíveis.
7. Exiba a linha de medição 2x mantendo pressionado o modo M e coloque-o na junção do anel da válvula tricúspide e da parede livre do ventrículo direito. Meça a distância de deslocamento da válvula tricúspide (TAPSE) em pelo menos três ciclos cardíacos e preserve-a em Cine.
8. Coloque a sonda na linha média da clavícula direita do peito do animal e ajuste o ângulo entre a sonda e o entalhe do peito do animal para cerca de 45°. Ajuste a imagem no modo B para que o ventrículo direito e o septo interventricular fiquem visíveis.
9. Selecione o Modo M para exibir a linha de medição 2x e coloque a linha de medição no meio do septo interventricular. A linha de amostragem foi perpendicular à parede livre do ventrículo direito. Salve a imagem para obter a espessura da parede livre do ventrículo direito.

4. Estimativa da função pulmonar

1. Abra o software PFT e verifique se o dispositivo é reconhecido. Calibre de acordo com as instruções do equipamento para garantir a precisão dos sensores de fluxo e sensores de pressão. Defina parâmetros de teste no software PFT, como frequência respiratória, volume corrente, duração do teste, etc.
2. O modo de detecção de animais é o modo para estudos com ratos. Ligue o interruptor do instrumento de controle principal e certifique-se de que o interruptor de cada sinal amplifier está na posição desligada.
3. Defina o fluxo de ar de acordo com o peso corporal do animal. Ligue a porca reguladora do fluxo de ar de sucção e ajuste a inspiração em 5. Ligue a porca reguladora do fluxo de ar expiratório e defina a expiração lenta para -4. Defina o valor da pressão para 60 cm H₂O e, em seguida, calibre o instrumento de acordo com a ordem do fluxo FRC, fluxo, fluxo alto e pressão pulmonar com um erro inferior a 0.5%.
4. Anestesiar ratos por injeção intraperitoneal com pentobarbital sódico (45 mg/kg) como na etapa 2.2. Corte a pele ao longo do centro do pescoço e remova o músculo camada por camada.
5. Na porção superior exposta da traqueia cervical, faça uma incisão horizontal entre os anéis da cartilagem traqueal. Insira rapidamente a cânula de metal na incisão traqueal, garantindo que a cânula esteja posicionada corretamente e segura. Use suturas de fio de seda 4-0 para fixar a cânula à traqueia, evitando que ela escorregue ou se desloque. Coloque o rato no compartimento do animal PFT e conecte a cânula traqueal à interface do canal de fluxo de ar fora do instrumento.
6. Clique no botão Iniciar e examine a capacidade vital forçada (CVF) e a complacência pulmonar dinâmica. Para garantir a consistência dos dados, registre cada indicador pelo menos 3x.
7. Após a conclusão do teste, os dados são salvos e exportados para o software de análise. Use software estatístico para analisar os dados e comparar os parâmetros de função pulmonar de diferentes grupos.

5. Medidas hemodinâmicas e histológicas

1. Detecção de pressão sistólica do ventrículo direito (RVSP)
   1. Anestesiar ratos por injeção intraperitoneal com pentobarbital sódico (45 mg/kg) como na etapa 2.2. Confirme se o rato foi devidamente anestesiado, beliscando o dedo do pé para garantir que o rato não responda. Fixe o abdômen do rato para cima na bancada experimental e aplique creme para os olhos do rato para evitar o ressecamento.
   2. Faça uma incisão (cerca de 4 cm) no lado direito do pescoço através de tesoura cirúrgica e separe a veia jugular externa através de pinça microcirúrgica. Separe as veias com um comprimento de cerca de 1 cm suavemente com microfórceps e insira duas linhas cirúrgicas nas extremidades distal e proximal.
   3. Antes da intubação, mergulhe o tubo PE50 em solução salina normal contendo heparina sódica a 1% ou EDTA por pelo menos 30 minutos. Ajuste o registrador fisiológico para trazer a pressão de volta à linha 0 e ajuste a faixa de pressão para 0-150 mmHg.
   4. Ligue a extremidade distal da veia jugular externa com fio de seda 4-0, levante suavemente a linha cirúrgica proximal e coloque-a na parede da veia distal. Use uma tesoura pequena para fazer uma pequena incisão (cerca de 0,3 mm). Depois de inserir o tubo PE50 na veia jugular externa, use fio de seda 4-0 para ligar o cateter junto com a veia jugular externa para evitar vazamento de sangue.
   5. Observe a forma de onda da pressão venosa no registrador. Empurre o cateter lentamente para o átrio direito e a forma de onda do átrio direito é visível, com uma amplitude de cerca de 0-5 mmHg. Depois que o cateter continua a avançar do átrio direito para o ventrículo direito, a forma de onda de pressão do ventrículo direito pode ser vista. Quando a pressão estiver estável, registre o RVP por 5 min e os dados serão salvos e analisados com software de análise.
2. Detecção do índice de Fulton
   1. Após a detecção de RVSP, após anestesia com isoflurano (5%, 2 L/min O₂), eutanasiar os ratos por meio de exsanguinação.
   2. Após a toracotomia, remova o coração intacto do rato com uma pinça. Corte a aurícula e o tecido conjuntivo próximo ao coração com uma tesoura.
   3. Corte a parede livre do ventrículo direito ao longo da artéria pulmonar. Este tecido é o ventrículo direito (VD). Os demais tecidos são ventrículo esquerdo mais septo interventricular (VE+S). Após a separação, drenar a superfície do ventrículo direito (VD) e do ventrículo esquerdo mais o septo interventricular (VE + S) com papel de filtro e pesar separadamente com uma balança analítica. Após registrar o peso do ventrículo direito (VD) e do ventrículo esquerdo mais septo ventricular (VE+S), calcule a relação de peso do ventrículo direito para o ventrículo esquerdo mais septo ventricular (VD/(VE+S)).
3. Coloração histológica
   1. Depois de abrir a cavidade torácica, use uma seringa de 10 mL para extrair 3 mL de solução salina. Insira a seringa na artéria pulmonar e injete lentamente a solução salina para lavar os pulmões, removendo sangue e outros resíduos.
   2. Use uma tesoura para dissecar o lobo acessório direito e o lobo anterior direito do pulmão. Coloque esses dois lobos pulmonares em formalina a 4% para fixação para preservar a morfologia e a estrutura do tecido. Coloque rapidamente os três lobos restantes do pulmão (como o pulmão esquerdo, o lobo médio direito e o lobo posterior direito) em nitrogênio líquido para armazenamento congelado, pronto para experimentos subsequentes.
   3. Remova o excesso de gordura e tecido conjuntivo da superfície do tecido pulmonar para garantir que os blocos de tecido estejam limpos e limpos. Apare os lobos pulmonares em pequenos blocos medindo 5 mm x 5 mm x 3 mm. Coloque os blocos de tecido aparado no desidratador e desidrate-os gradualmente usando uma série gradiente de álcool (60%, 70%, 80%, 90%, 100%).
   4. Mergulhe o tecido pulmonar em xileno por 2 h para obter transparência. Após a remoção, mergulhe-o em parafina derretida a 56-58 °C por 2 h para garantir a infiltração completa. Em seguida, coloque o tecido em um molde, posicionando-o com a superfície de corte voltada para baixo para posterior seccionamento.
   5. Corte o bloco de cera no micrótomo com uma espessura de 4-8 μm¹³ e guarde-o em temperatura ambiente para coloração patológica.
   6. Realize a coloração tricrômica de Eosin e Masson¹⁴.

6. Detecção de hidroxiprolina (HYP)

1. Pesar 30-100 mg de tecido pulmonar em um tubo de vidro. Adicione 2 ml de solução de ácido clorídrico (6 mol/L) e digerir a 110 °C numa estufa durante 2-6 h até que não sejam visíveis grumos grandes.
2. Após o resfriamento, ajuste o valor do pH para a faixa de 6-8 usando 1 mL de solução de NaOH (10 mol/L) e, em seguida, condense a água destilada em 4 mL de solução. Por fim, centrifugar a 28,620 x g a 25 °C durante 20 min e tomar o sobrenadante como sendo o sobrenadante.
3. Pré-aqueça o leitor de microplacas por 30 min, ajuste o comprimento de onda para 560 nm e zere o instrumento usando água destilada.
4. Diluir a solução-padrão com água destilada para preparar soluções-padrão com concentrações de 30, 15, 7,5, 3,75, 1,875, 0,938, 0,469 e 0,234 μg/ml.
5. Pegue 60 μL do sobrenadante da amostra e misture com 60 μL de Reagente A, depois deixe repousar em temperatura ambiente por 20 min.
6. Adicione 60 μL de Reagente B e 120 μL de água destilada. Colocar a solução misturada em banho-maria a 60 °C durante 20 min. Siga as mesmas etapas para cada concentração das soluções padrão (por exemplo, 30, 15, 7,5, 3,75, 1,875, 0,938, 0,469, 0,234 μg/mL) e execute as operações de acordo.
7. Depois de permanecer em temperatura ambiente por 15 min, pegue 200 μL da solução na placa de 96 poços para detectar o valor de absorção de luz a 560 nm. Traçar a curva padrão com a concentração das soluções-padrão como eixo x e os valores medidos como eixo y, obtendo a equação y=kx+b. Substitua o valor medido da amostra na equação para determinar a concentração da amostra.

Resultados

Fibrose pulmonar induzida por bleomicina em ratos
A bleomicina tem sido relatada como um indutor clássico de fibrose pulmonar em modelos animais⁷. Aqui, os índices de fibrose pulmonar foram avaliados após a estimulação BLM. Primeiro, após 35 dias de tratamento com BLM, realizamos testes de função pulmonar e descobrimos que tanto a CVF (Figura 1E) quanto a complacência pulmonar dinâmica (

Discussão

A fibrose pulmonar idiopática é uma doença progressiva e fatal com sobrevida mediana de 2-3 anos a partir do diagnóstico, sugerindo um prognóstico sombrio⁹. A hipertensão pulmonar é uma comorbidade comum da FPI, que deteriora rapidamente a FPI com piora do prognóstico¹⁵. Além disso, havia opções terapêuticas limitadas para FPI-PH⁷. Assim, é essencial obter uma compreensão mais profunda dos mecanismos mo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleomycin	MedChemExpress	HY-17565A
Coupling agent	HYNAUT	BX-CSRH
Formalin fixative	Biosharp)	BL401B
Hair removal cream	LUSEN	LS-B-TMG-50
Hematoxylin eosin (HE) staining kit	Beyotime	C0189S
Isoflurane	RWD Life Science(China)	R510-22-10
Masson Tri-color dyeing kit	Beyotime	C0189S
Normal saline	KERONG	SLYS-001
syringe	Beyotime	FS701-50pcs