Lung Arterial Hypertension Associated with Pulmonary Fibrosis의 쥐 모델 수립 및 검증

요약

본 연구에서는 블레오마이신을 기도에 주입하여 폐섬유증(PF-PH) 랫트 모델과 관련된 폐동맥 고혈압을 유발하는 방법을 소개합니다. 또한 이 동물 모델을 검증하기 위한 단계별 접근 방식을 제공합니다.

초록

폐섬유증이 있는 환자는 예후가 좋지 않은 합병증인 폐고혈압이 발생할 위험이 더 높습니다. 현재로서는 이 연결의 메커니즘이 아직 잘 이해되지 않고 있습니다. 이 분야의 발전을 가로막는 주요 장애물은 PF-PH를 복제할 수 있는 신뢰할 수 있는 동물 모델이 없다는 것입니다. 본 연구는 안정적인 PF-PH 랫트 모델을 확립하는 것을 목표로 하였다. 쥐는 개입하기 전에 밤새 금식했습니다. 펜토바르비탈나트륨 마취(45 mg/kg) 하에, 3 cm 깊이(성문에서 튜브까지의 거리)까지 삽입된 PE50 튜브로 기관을 삽관하였다. 블레오마이신(BLM)을 단일 용량(5mg/kg, 0.9% NaCl 0.2mL에 용해)으로 기관내 투여했습니다. 주입 후, BLM의 균일한 분포를 보장하기 위해 쥐를 즉시 회전시켰습니다. BLM 주사 후 35일이 지난 시점에 쥐는 폐 기능의 점진적인 손상과 우심실 수축기 압력 및 우심실 비대가 증가하여 폐 고혈압의 병리학적 특성을 밝혔습니다. 우리는 PF-PH의 쥐 모델을 확립하기 위한 일반적이고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

서문

간질성 폐질환(interstitial lung disease, ILD)으로 인한 폐고혈압(PH)은 임상적으로 흔하며, 특발성 폐섬유증(IPF) 환자에서 10%에서 80%의 유병률이 추정되며, 다른 섬유화성 ILD에서도 자주 발견된다 ^1,2. 수많은 연구에서 PH의 발병이 상당한 이환율 및 생존율 감소와 관련이 있음을 보여주었습니다 ^3,4,5. 그룹 1 폐동맥 고혈압(PAH)과 비교했을 때, 폐섬유증(PF-PH)과 관련된 폐동맥 고혈압의 발병 기전은 아직 잘 알려져 있지 않다⁶. 쥐에서 PF-PH의 동물 모델을 확립하는 목적은 폐고혈압과 관련된 폐 섬유증에 대한 과학적 연구를 위한 신뢰할 수 있는 프레임워크를 제공하고 임상 치료 응용을 위한 잠재적인 방법을 모색하는 것입니다.

블레오마이신(Bleomycin)은 동물 모델에서 널리 사용되는 전형적인 폐섬유증 유도제입니다⁷. Blackburn 등⁸ 과 본 연구실⁹ 의 추가 연구는 블레오마이신이 우심실 수축기 압력(RVSP) 및 우심실 비대와 같은 폐 고혈압의 전형적인 병리학적 특징을 유발할 수도 있음을 밝혔습니다. 기계적으로 블레오마이신은 폐실질 섬유증, 저산소성 혈관 수축 및 폐 혈관 바닥 밀도 감소를 유도하여 폐 고혈압의 발병을 유발합니다⁶. 또한, 블레오마이신 치료 7일째부터 폐혈관 내피 세포의 상당한 손실이 관찰되었으며, 이 손실은 실험⁹ 과정에서 점진적으로 악화되었습니다. 이러한 현상은 블레오마이신에 의한 폐혈관 내피 기능 장애가 폐고혈압의 시작과 진행에 잠재적인 역할을 할 수 있음을 시사합니다.

폐간질성 섬유증으로 인해 IPF 환자는 장기간 저산소증 상태에 있으며, 심폐혈관에 보상적 변화가 일어나 폐고혈압을 유발한다⁶. 동물 모델을 사용하면 폐고혈압과 관련된 인간 특발성 폐섬유증의 기저부전을 더 잘 이해할 수 있습니다. 이 모델이 인간 질병의 병리학적 특징을 완전히 시뮬레이션할 수는 없지만 이 모델은 여전히 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 폐 섬유증을 모방하는 많은 실험 모델이 있는데, 예를 들어 블레오마이신의 1회 투여 기도 주입, 형질전환 성장 인자의 바이러스 벡터 전달, 실리카 ^8,10에 대한 노출이 있습니다. 현재 BLM 모델은 단시간에 쉽게 유도할 수 있고 재현성이 높기 때문에 가장 널리 사용되고 특성화된 모델입니다. 또한, 폐 섬유증의 시간적 변화는 블레오마이신 마우스 모델에서 평가되었으며, Col1A1 및 Col1A2와 같은 질병 병리학과 관련된 섬유증 마커 및 유전자의 발현 증가가 15-21일⁸일에 관찰되었습니다. 우심실 비대 및 RVSP의 현저한 증가와 같은 심혈관 변화는 33일째 또는 그 이후에 감지되었다¹¹. 동시에 본 연구실에서는 이전에 블레오마이신⁹에 의해 유도된 쥐 모델의 PH 및 PF 매개변수의 변화를 평가한 바 있습니다. 우리는 쥐에서 진행성 폐 기능 손상 및 콜라겐 침착과 같은 폐 섬유증(PF) 특성 외에도 폐 고혈압(PH)의 전형적인 특징이 블레오마이신을 한 번 기도에 주입한 후 7일에서 35일 이내에 점진적으로 나타나는 것을 발견했습니다. RVSP와 Fulton 지수는 시간 의존성이 증가한 것으로 나타났습니다. 현재 폐섬유증을 앓고 있는 다양한 동물이 문헌에 보고되어 있습니다. 일부 전문가들은 쥐 모델이 쥐 모델보다 더 뚜렷한 섬유화 반응을 보였다고 제안했다¹². 따라서 폐고혈압과 결합된 폐섬유증의 진행을 더 잘 연구하기 위해서는 블레오마이신 유도 쥐 모델이 핵심입니다.

프로토콜

본 연구에서 기술된 동물실험은 광저우 의과대학 제1부속병원 동물관리 및 이용위원회(윤리승인번호: 2018-456)의 승인을 받았다.

1. 실험용 쥐 조달

1. 쥐를 정상 대조군과 모델 그룹의 두 그룹으로 나누고 각 그룹에는 7마리의 쥐가 있습니다. 연구를 위해 체중이 200 ± 20 주된 10 주 된 수컷 Sprague-Dawley (SD) 쥐를 사용하십시오.

2. PF-PH 랫트 모델의 유도

1. 시술 중 흡인이 역류하는 것을 방지하기 위해 모델링하기 전에 밤새 쥐를 금식하십시오.
2. 펜토바르비탈 나트륨(45mg/kg)을 복강내 주사하여 쥐를 마취시켜 절차의 정확성과 안전성을 보장하고 동물의 통증과 스트레스를 최소화합니다. 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족으로 외과적 마취 수준을 확인합니다. 동시에 건조를 방지하기 위해 쥐의 눈에 연고를 바르십시오.
3. PE50 튜브를 3cm 깊이(성문에서 튜브까지의 거리)까지 삽입하여 쥐의 기관을 삽관합니다.
4. 1mL 주사기(26G)를 사용하여 0.2mL의 블레오마이신(5mg/kg, 0.9% NaCl 0.2mL에 용해)을 추출합니다. BLM이 포함된 주사기를 캐뉼라를 통해 1회 용량으로 기도에 주입합니다. 대조군에 속한 쥐의 경우, 멸균 생리식염수(0.2mL)를 기관내 투여한다. 이 과정에서 쥐는 통증 완화가 필요하지 않습니다.
5. 블레오마이신의 균일한 분포를 보장하려면 쥐를 누운 자세로 놓고 부드럽게 잡고 천천히 회전합니다. 권장 회전 각도는 30°-45°이며 측면을 번갈아 가며 회전합니다. 각 회전은 10-15초 동안 유지되어야 하며 3x-4x를 반복해야 합니다.
6. 쥐를 발열 패드에 올려 체온을 유지하고 상태를 면밀히 모니터링하십시오. 쥐가 스스로 움직이기 시작하고 회복을 위해 발열 패드에서 동물을 별도의 우리로 옮기는 시점을 관찰하십시오.
7. BLM 주입 5주 후, 쥐를 평가하여 심초음파 모니터링, 혈류역학적 측정 및 조직학적 분석과 같은 방법을 사용하여 PF-PH 모델을 성공적으로 설정할 수 있는지 여부를 결정합니다.

3. 심초음파 모니터링

1. 4% 이소플루란을 사용하여 쥐를 마취합니다. 제모 크림으로 쥐의 털을 제거하고 가슴에 초음파 젤을 바릅니다.
2. 250MHz 초음파 프로브로 쥐에서 오른쪽 심장의 기능 및 구조적 매개변수를 평가합니다. 심실을 가장 잘 장축으로 보려면 동물의 가슴 중앙선 왼쪽에 프로브를 놓습니다.
3. 개별 해부학적 구조에 따라 앞니가 오른쪽 어깨를 가리키도록 프로브를 왼쪽 흉골 선을 기준으로 시계 반대 방향으로 15° 회전하고 B 모드에서 x축과 y축을 조정하여 심장 전체가 시야의 중앙에 오도록 합니다.
4. 색상을 선택하여 폐동맥을 구별하기 위해 혈류 색상을 표시합니다(이 위치의 폐동맥 혈류 신호는 파란색).
5. PW(PW 도플러) 모드를 선택하고 s를 배치하십시오.amp폐 밸브 아래에 있는 링 라인을 만들고 PW 각도 손잡이를 돌려 s의 방향을 조정합니다.amp링 라인이 amp링 방향이 폐동맥 혈류 방향(약 25°)과 평행합니다. PW 키를 다시 누르고 폐동맥 혈류 가속 시간/배출 시간(PAT/PET)을 구합니다. 최소 5개의 심장 주기와 평균을 측정합니다. Cine을 사용하여 이미지를 저장합니다.
6. 동물을 낮은 머리와 높은 발로 조정하고, 초음파 프로브를 동물의 심장 정점에 놓고, 심장 정점을 따라 초음파를 구동하여 4 개의 챔버 절치 표면을 얻습니다. B 모드에서 x축과 y축을 조정하여 4개의 심실이 보이도록 합니다.
7. M 모드를 누른 상태에서 측정 라인을 2x 표시하고 삼첨판 링과 우심실 자유벽의 접합부에 놓습니다. 최소 3번의 심장 주기 내에서 삼첨판 변위 거리(TAPSE)를 측정하고 Cine에 보존합니다.
8. 동물의 가슴의 오른쪽 쇄골 정중선에 프로브를 놓고 프로브와 동물의 가슴 노치 사이의 각도를 약 45°로 조정합니다. B-모드에서 이미지를 조정하여 우심실과 심실 중격이 보이도록 합니다.
9. M-Mode를 선택하여 측정 라인 2x를 표시하고 측정 라인을 심실 중격 중간에 배치합니다. 샘플링 라인은 우심실 자유 벽에 수직이었습니다. 이미지를 저장하여 우심실 자유벽의 두께를 얻습니다.

4. 폐 기능 추정

1. PFT 소프트웨어를 열고 장치가 인식되는지 확인합니다. 유량 센서 및 압력 센서의 정확성을 보장하기 위해 장비 지침에 따라 보정합니다. PFT 소프트웨어에서 호흡수, 일회량, 테스트 기간 등과 같은 테스트 매개변수를 설정합니다.
2. 동물 감지 모드는 쥐 연구를 위한 모드입니다. 주 제어 기기의 스위치를 켜고 각 신호의 스위치가 ampliifier가 꺼짐 위치에 있습니다.
3. 동물의 체중에 따라 공기 흐름을 설정하십시오. 흡입 기류 조절 너트를 켜고 인스피레이션을 5로 설정합니다. 호기 기류 조절 너트를 켜고 느린 호기음을 -4로 설정합니다. 압력 값을 60cm H₂O로 설정한 다음 0.5% 미만의 오류로 FRC 유량, 유량, 고유량 및 폐 압력의 순서에 따라 기기를 보정합니다.
4. 2.2단계에서와 같이 펜토바르비탈 나트륨(45mg/kg)을 복강내 주사하여 쥐를 마취합니다. 목 중앙을 따라 피부를 절개하고 근육을 층층이 제거합니다.
5. 경추 기관의 노출된 상부에서 기관 연골 고리 사이를 수평으로 절개합니다. 금속 캐뉼러를 기관 절개 부위에 빠르게 삽입하여 캐뉼라가 올바른 위치에 고정되었는지 확인합니다. 4-0 견사 봉합사를 사용하여 캐뉼라를 기관에 고정하여 미끄러지거나 빠지는 것을 방지합니다. 쥐를 PFT 동물 구획에 넣고 기관 캐뉼러를 기기 외부의 공기 흐름 채널 인터페이스에 연결합니다.
6. 시작 버튼을 클릭하고 강제 폐활량(FVC) 및 동적 폐 순응도를 검사합니다. 데이터 일관성을 보장하려면 각 지표를 3회 이상 기록하십시오.
7. 테스트가 완료되면 데이터가 저장되고 분석 소프트웨어로 내보내집니다. 통계 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 다른 그룹의 폐 기능 매개변수를 비교합니다.

5. 혈역학 및 조직학적 측정

1. 우심실 수축기 혈압(RVSP) 감지
   1. 2.2단계에서와 같이 펜토바르비탈 나트륨(45mg/kg)을 복강내 주사하여 쥐를 마취합니다. 쥐가 반응하지 않도록 발가락을 꼬집어 쥐가 제대로 마취되었는지 확인합니다. 실험대에서 쥐의 복부를 위로 고정하고 쥐의 눈에 아이크림을 바르면 건조함을 방지할 수 있습니다.
   2. 수술용 가위로 목 오른쪽을 절개(약 4cm)하고 미세수술용 겸자로 외부 경정맥을 분리합니다. 약 1cm 길이의 정맥을 마이크로 집게로 부드럽게 분리하고 원위부와 근위부 끝에 두 개의 수술 라인을 삽입합니다.
   3. 삽관 전에 PE50 튜브를 1% 헤파린 나트륨 또는 EDTA가 함유된 생리식염수에 최소 30분 동안 담그십시오. 생리적 레코더를 조정하여 압력을 0 라인으로 되돌리고 압력 범위를 0-150mmHg로 조정합니다.
   4. 4-0 명주실로 외부 경정맥의 말단부를 접합하고 근위 수술 라인을 부드럽게 들어 올려 원위 정맥 벽에 놓습니다. 작은 가위를 사용하여 작은 절개 부위 (약 0.3mm)를 만듭니다. PE50 튜브를 외부 경정맥에 삽입한 후 4-0 명주실을 사용하여 카테터를 외부 경정맥과 함께 접합하여 혈액 누출을 방지합니다.
   5. 레코더에서 정맥 압력 파형을 관찰하십시오. 카테터를 오른쪽 심방으로 천천히 밀어 넣으면 약 0-5mmHg의 진폭으로 오른쪽 심방 파형이 보입니다. 카테터가 우심방에서 우심실로 계속 진행한 후 우심실 압력 파형을 볼 수 있습니다. 압력이 안정되면 RVP를 5분 동안 기록하고 데이터를 분석 소프트웨어로 저장 및 분석합니다.
2. Fulton 지수 검출
   1. RVSP가 검출된 후 이소플루란 마취(5%, 2 L/min O₂)에 따라 박리를 통해 쥐를 안락사시킵니다.
   2. 개흉술 후 핀셋으로 쥐의 손상되지 않은 심장을 제거하십시오. 심장 근처의 귓바퀴와 결합 조직을 가위로 잘라냅니다.
   3. 폐동맥을 따라 우심실의 자유벽을 자릅니다. 이 조직은 우심실(RV)입니다. 나머지 조직은 좌심실과 심실중격(LV+S)입니다. 분리 후 우심실(RV)과 좌심실 및 심실 중격(LV+S)의 표면을 여과지로 배출하고 분석 저울을 사용하여 별도로 칭량합니다. 우심실(RV)과 좌심실과 심실 중격(LV+S)의 무게를 기록한 후 좌심실과 심실 중격(RV/(LV+S))에 대한 우심실의 무게 비율을 계산합니다.
3. 조직학적 염색
   1. 흉강을 연 후 10mL 주사기를 사용하여 식염수 3mL를 추출합니다. 주사기를 폐동맥에 삽입하고 식염수를 천천히 주입하여 폐를 씻어내고 혈액 및 기타 잔류물을 제거합니다.
   2. 가위를 사용하여 폐의 오른쪽 부속엽과 오른쪽 전엽을 절개합니다. 이 두 개의 폐엽을 4% 포르말린에 넣어 고정하면 조직의 형태와 구조를 보존할 수 있습니다. 폐의 나머지 3개 엽(예: 왼쪽 폐, 오른쪽 중간 엽, 오른쪽 후방 엽)을 액체 질소에 빠르게 넣어 냉동 보관하고 후속 실험을 준비합니다.
   3. 폐 조직 표면에서 과도한 지방과 결합 조직을 제거하여 조직 블록이 깨끗하고 깔끔한지 확인합니다. 폐엽을 5mm x 5mm x 3mm 크기의 작은 블록으로 자릅니다. 트리밍된 조직 블록을 탈수기에 넣고 일련의 알코올(60%, 70%, 80%, 90%, 100%)을 사용하여 점차적으로 탈수합니다.
   4. 투명도를 얻기 위해 폐 조직을 자일렌에 2시간 동안 담그십시오. 제거 후 56-58 ° C에서 2 시간 동안 녹은 파라핀에 담가 완전한 침투를 보장합니다. 그런 다음 조직을 금형에 넣고 후속 절단을 위해 절단 표면이 아래를 향하도록 배치합니다.
   5. 마이크로톰의 왁스 블록을 4-8μm¹³ 두께로 얇게 썰어 병리학적 염색을 위해 실온에 보관합니다.
   6. Eosin과 Masson의 삼색 염색¹⁴를 수행합니다.

6. 하이드록시프롤린(HYP) 검출

1. 유리관에 30-100mg의 폐 조직을 넣습니다. 염산 용액 2mL(6mol/L)를 넣고 큰 덩어리가 보이지 않을 때까지 110°C의 오븐에서 2-6시간 동안 분해합니다.
2. 냉각 후 NaOH 용액 1mL(10mol/L)를 사용하여 pH 값을 6-8 범위로 조정한 다음 증류수를 4mL 용액으로 응축합니다. 마지막으로, 25°C에서 28,620 x g 에서 20분 동안 원심분리하고 상층액을 취합니다.
3. 마이크로플레이트 리더를 30분 동안 예열하고 파장을 560nm로 조정한 다음 증류수를 사용하여 기기를 영점 조정합니다.
4. 표준 용액을 증류수로 희석하여 30, 15, 7.5, 3.75, 1.875, 0.938, 0.469 및 0.234μg/mL 농도의 표준 용액을 준비합니다.
5. 60μL의 샘플 상등액을 60μL의 시약 A와 혼합한 다음 실온에서 20분 동안 그대로 둡니다.
6. 60μL의 시약 B와 120μL의 증류수를 추가합니다. 혼합 용액을 60°C 수조에 20분 동안 놓습니다. 표준 용액의 각 농도(예: 30, 15, 7.5, 3.75, 1.875, 0.938, 0.469, 0.234μg/mL)에 대해 동일한 단계를 따르고 그에 따라 작업을 수행합니다.
7. 실온에서 15분 동안 방치한 후 96웰 플레이트에 용액 200μL를 넣어 560nm에서 광 흡수 값을 검출합니다. 표준 용액의 농도를 x축으로, 측정값을 y축으로 사용하여 표준 곡선을 플로팅하여 y=kx+b 방정식을 얻습니다. 샘플의 측정값을 방정식에 대입하여 샘플의 농도를 결정합니다.

결과

쥐의 블레오마이신 유발 폐 섬유증(Bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats)
블레오마이신(Bleomycin)은 동물 모델에서 폐 섬유증의 고전적인 유도제로 보고되었습니다⁷. 여기서, BLM 자극 후 폐 섬유증의 지수를 평가하였다. 먼저, BLM 치료 35일 후 폐 기능 검사를 실시한 결과, 모델 그룹에서 FVC(그림 1E)와 동적 폐 순응도(

토론

특발성 폐섬유증은 진단을 받은 후 평균 2-3년 생존 기간을 가진 진행성 치명적인 질환으로, 암울한 예후를 시사한다⁹. 폐고혈압은 IPF의 흔한 동반질환으로, IPF는 급격히 악화되고 예후가 악화된다¹⁵. 더욱이 IPF-PH⁷에 대한 치료 옵션은 제한적이었습니다. 따라서 PF-PH의 기본 분자 메커니즘에 대한 심층적인 이해를 얻는 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleomycin	MedChemExpress	HY-17565A
Coupling agent	HYNAUT	BX-CSRH
Formalin fixative	Biosharp)	BL401B
Hair removal cream	LUSEN	LS-B-TMG-50
Hematoxylin eosin (HE) staining kit	Beyotime	C0189S
Isoflurane	RWD Life Science(China)	R510-22-10
Masson Tri-color dyeing kit	Beyotime	C0189S
Normal saline	KERONG	SLYS-001
syringe	Beyotime	FS701-50pcs