健康/国立がん研究所の助成金（チャールズJ. DimitroffにRO1CA118124）の国立研究所;このプロジェクトの資金は、アメリカ癌協会の研究Scholarの賞、（チャールズJ. Dimitroff〜06 - 024 - 01 - CSM）によって提供されたと関節炎と筋骨格および皮膚疾患の助成金（;ブリガム女性病院、ボストン、マサチューセッツ博士トーマスS.クッパーへP30 AR042689）の健康/国立研究所の国立研究所。

1。 hBMECの準備（HBMEC - 60細胞）フローチャンバーのためのペトリ皿に単層<ol><li> 4℃で一晩コート3520μg/mlのフィブロネクチンの2ミリリットルと× 10mmの組織培養皿（PBS中）° Cまたは37 ° 3時間℃での</li><li>料理からフィブロネクチンソリューションを吸引し、1.5 × 10 5 HBMEC - 60細胞をHEPES＆グルタミンと[中] 199、10％FBS、10％ヒト血清、5単位/ mlヘパリン、1ng/ml組換えヒト繊維芽細胞増殖因子、1％ペニシリンを追加するストレプトマイシン]皿にし、それらを&gt; 90％コンフルエントにまで成長することができます。 （これは2日かかります） </li><li>増殖培地を吸引し、E -セレクチンの発現をアップレギュレートするため、4-6時間のために50ng/mLのIL -1βで新鮮な培地を加​​える。細胞単層は、現在分析を圧延するための準備が整いました。 E -セレクチンの機能を遮断するには、抗ヒトE -セレクチンモアブ（クローンBBIG - E4（5D11））で37〜1時間のために20μg/mlで添加することができます℃を中和する</li></ol> 2。フローチャンバーのためのヒト造血前駆KG1a細胞の調製<ol><li>ヒト造血前駆KG1a細胞はグルタミンを含むRPMI - 1640で（1 × 10 6細胞/ ml）コンフルエントまで増殖させ、10％FBS / 1％ペニシリン-ストレプトマイシン及びフローチャンバーアッセイで使用するためにフラスコから直接ピペットでされています。 </li><li>細胞数を血球計算盤を用いて計算され、その後、細胞は、10mMのHEPES（H / Hバッファ）および2mM CaCl 2をHBSSで1 × 10 6細胞/ mLで再懸濁し、 </li><li>細胞をアッセイに使用するまで氷上で保存されています。 </li></ol> 3。顕微鏡、パラレルプレートフローチャンバー及びシリンジポンプ（図1）の調製<img src="/files/ftp_upload/old/1009_2009_1_26_7/1009_figure1.png" alt="図1" width="600" height="409" /> 図1平行平板フローチャンバー分析のイラスト。倒立顕微鏡、ハーバードシリンジポンプ、コンピューター/カメラと平行平板フローチャンバーは、効率的かつ再現可能な細胞解析のための最適な配置で配置されます。 <ol><li>倒立顕微鏡とパワーにシリンジポンプに電源と光源の電源を入れ、顕微鏡で10倍の対物を選択します。 </li><li>ホルダーに50mLのコニカルチューブを配置し、H / Hおよび2mM CaCl 2を入力してください。 </li><li> 50mLのコニカルチューブ下の試験管ホルダーの代わりに5ミリリットルのプラスチック試験管</li><li>シリンジポンプの代わりに60mlの注射器（シリンジのプランジャーと本体の両方が両方とも固定されていることを確認してください）​​。 </li><li> 60mlのシリンジの終わりと3方コックに5mLのシリンジを接続する3ウェイコックを取り付けます。 </li><li>出力管は背面に、左と真空管に、右側に入力チューブと顕微鏡のステージ上でパラレルフローチャンバー装置（GlycoTech、（株））を置きます。 </li><li>平行平板装置がステージに付着できるように真空とオープンエアのバルブに真空のチューブを取り付けます。 （このテストフローチャンバーの真空のスカートが気密の場合。）エアーバルブをオフにします。 </li><li>出力チューブライン（顕微鏡の左側）3ウェイコックにして取り付けます。装置は、現在HBMEC - 60単層板上に配置するために用意されています。 </li><li>顕微鏡の中央上にHBMEC - 60単層板と場所に置きます。 </li><li>真空と位置単層板が中央にくるようにプレート上のフローチャンバー装置をオンにします。 </li><li>優しくHBMEC - 60単層プレート上にフローチャンバー装置を下げ、フローチャンバー装置がダウンして吸引することができます。 （エスケープとこの時点で、ゴム製のガスケットを圧縮するためにチャンバに圧力を適用する必要があります空気のない音はないはずです。） </li><li>一度真空は場所の入力管は2mm CaCl 2をH / Hを含む50mLのコニカルチューブに（右上）、確立されている。 </li><li>オープン3方コックで60mlの注射器と場所のポンプに流入できるように、&quot;ポンプのモードを。&quot; </li><li>プレート上の細胞を持ち上げることなく、入力/出力ラインから空気を除去するために、吸気管を埋めるために2mL/minuteで設定されたシリンジポンプを使用して、その後すぐに液体が装置に到達する直前に、0.5ml /分に設定します。それは慎重にこのセットをプライミングし、プレートから単分子層を解除する気泡を避けるために不可欠です。 </li><li>液体が60ミリリットル注射器に移動させる見られている一度、フローチャンバーとシリンジポンプをプライムし、フローチャンバーは使用できる状態になっている。このセットは、最大各セルの入力の実行のために、必要に応じ、それぞれ新たなプレートに対して繰り返されます。 </li></ol> 4。 NISの要素を用いて白血球のローリングイベントのキャプチャ<ol><li>デスクトップ上で開いているNISの要素。 </li><li>ライブ画像のアイコンを&quot;再生&quot;を押します。自動露出では、今のプレートが簡単に参照できるように、フォーカシングのために重要であるだろう。 </li><li>顕微鏡は、細胞単層上で適切に焦点を当てていることを確認してください。 </li><li>ピントが合う、1フレーム/秒への曝露を再設定し、顕微鏡で光を調整する。画像がコンピュータに表示され、もはや低光レベルに起因する顕微鏡のファインダーの見えないはずです。光のヒストグラムは、広告することができます背景の露出を削除したり、細胞の明瞭さを向上させるためにjusted。 </li><li>ムービーキャプチャに最適な画像を得るために2X2ビンまたはライブビンをクリックしてください</li><li> &quot;オープン&quot;を選択しポート&quot;COM3、&quot;と、メニューバーの&quot;マクロ&quot;をクリックし、&quot;ポートへの書き込み&quot;を選択します。 （これは、シリンジポンプと調整するポートを開きます。 </li><li>その後ピペット入力配管ラインの近くに5ミリリットルを試験管にKG1a細胞懸濁液1mLとは、試験管の底に入力チューブラインを配置します。 </li><li>メニューバーに移動し、&quot;キャプチャ&quot;をクリックし、&quot;。タイムラプス買収&quot; </li><li>新しいメニューがポップアップします。 210秒持続するプロトコルを選択し、これはHBMEC - 60細胞に展開するためのプログラムの長さです。 （各フェーズは、画像のpumpプロトコルの間、毎秒取るようにプログラムされています。それはまた、ポンプを起動COM3ポートを介してコマンドを送信するように設定されている。）タイムラプスが中断された場合、ポンプは停止しません。自分自身で、リセットする必要があります。画像を生きるに戻るには[キャンセル]を押します。 </li><li>取扱説明書によると、&quot;プログラムモード&quot;にシリンジポンプを設定します。 （プログラムモードでは、チャンバー内で付与されるとHBMEC - 60細胞の単層を介してKG1a細胞相互作用を決定する特定の流量（すなわち、せん断応力レベル）を手動でプログラミングすることができます。）設定をhBMECセルにローリングKG1a細胞のためにバージョン4.2のダインを以下の通り45秒/ cm 2で 、60秒は0.3ダイン/ cm 2、及び段階的に増加する毎に15秒4.2ダイン/ cmの最大2〜 </li><li>チャンバー内の壁面せん断応力（W ST）は 、次式に従って算出した：W ST / mlの体積流量Qは、μは媒体の推定粘度（0.0076 P）である=6μQ/ 2 B、、 Sは、cm単位チャネルの高さ（ガスケットの厚さ）（0.03 cm）です、aとbはcm（0.5センチ）のチャネル幅です。流量はシリンジポンプのプログラムモードを使用して安定化された。 </li><li>顕微鏡とコンピュータは現在、コマ撮り写真をキャプチャする準備が整いました。データの取得を開始するコンピュータ上で&quot;実行開始&quot;を押します。プログラムの実行中に、メディアの完全な入力/出力チューブを（に気泡がないことを確認してください）​​を維持するために、KG1a細胞を含む試験管にメディアを追加してください。 </li></ol> 5。ターミナルのシアリル化とE -セレクチンを介したKG1aセル5の表面糖タンパク質の依存性。ローリング（図2; 5.1から5.5の動画クリップ） <ol><li>上圧延KG1a細胞のアッセイHBMEC - 60細胞の非刺激。（ネガティブコントロール）KG1a細胞を調製し、上記のようなライブHBMEC - 60以外のIL -1β刺激によるオーバーフローチャンバーに注入した。 </li><li>ライブ上述のようにHBMEC - 60、IL -1β刺激による上のKG1a細胞のアッセイ圧延でHBMEC - 60細胞でIL -1β。（E -セレクチン依存性の制御）前処理KG1a細胞を調製し、フローチャンバー内に注入した。 </li><li>抗ヒトE -セレクチンMoAbを中和するIL -1β、その後で前処理。（E -セレクチン依存性の制御）KG1a細胞が生以上の準備と流れチャンバーに注入されたIL - HBMEC - 60細胞のローリングKG1a細胞のアッセイ上記のような抗ヒトE -セレクチンMoAbを中和すると1β-刺激HBMEC - 60前処理。 </li><li> IL -1βで刺激したHBMEC - 60上を転動するシアリダーゼ消化KG1a細胞をアッセイする。 37℃1時間のためのノイラミニダーゼ0.1U/mlコレラ菌° Cで前処理したKG1a細胞は上のフローチャンバーに調製し、注入したライブIL -1β刺激による上記のようHBMEC - 60。 </li><li> IL -1βで刺激したHBMEC - 60上を転動するプロテアーゼ消化KG1a細胞をアッセイする。ライブ上述のようにHBMEC - 60、IL -1β刺激による上のプロテアーゼで前処理したKG1a細胞、37 1時間のための0.2U/mlブロメライン° Cを調製し、フローチャンバー内に注入した。 </li></ol> 6。 NIS - Elementsシリーズ - キャプチャされたKG1a細胞とKG1aセルローリングデータのグラフの解析<ol><li>時系列を取得した後、データを保存します。 </li><li>メニューバーの&quot;測定&quot;タブに移動し、選択し、&quot;しきい値を定義します。&quot;目的の細胞が赤色に着色されるようにバーを動かす。 &quot;すべてのイメージ&quot;は&quot;正常（Okay）&quot;を選択します。全体の時間経過のシーケンスは、表示される赤い圧延細胞を変更する必要があります。 </li><li> &quot;測定&quot;と選択して移動し、&quot;制限を。&quot; （制限は、ユーザーが圧延細胞を表していない閾値オブジェクトを除外することができます。これは、主にHBMEC - 60単層で作成された背景です。）圧延のセルの領域の&quot;領域&quot;と入力最小値と最大値を選択します。 &quot;伸び&quot;とは、この手順を繰り返します、&quot;真円度を。&quot; </li><li> &quot;尺度&quot;を選択し、&quot;制約を使用してバイナリを作成する&quot;を選択し、HBMEC - 60細胞の単層上に圧延細胞のNIS - Elementsシリーズはソフトウェアの認識を最適化するために、制限値を設定します。 </li><li> &quot;測定&quot;、&quot;フィールドのデータを&quot;選択し、&quot;リセットデータを&quot;選択に戻ります。このメニューを閉じます。 </li><li> &quot;測定&quot;とSEに戻る&quot;スキャンフィールド&quot;lect。 </li><li>開いている&quot;メジャー&quot;は、&quot;フィールドのデータは&quot;、&quot;数値またはオブジェクトを&quot;選択し、&quot;すべてのフィールドを&quot;選択して、データをMicrosoft Excelにエクスポートする。 </li><li>次のデータ収集のためにNIS - Elementsのセルの取得を準備する&quot;クリアデータ&quot;を選択します。 </li></ol>結果： <img src="/files/ftp_upload/old/1009_2009_1_26_8/1009_figure3.png" alt="図3" width="600" height="382" /> 図3。KG1a細胞上のE -セレクチン結合活性の平行平板フローチャンバーの分析。シアリダーゼまたはプロテアーゼで処理KG1a細胞は、HBMEC - 60細胞のIL -1βで前処理の単層上で効率をローリングについて分析した。実験を転がりネガティブコントロールは、HBMEC -60細胞非IL -1β-刺激または抗ヒトE -セレクチンMoAbを（5D11）の中和で治療IL -1βで刺激したHBMEC - 60細胞の上に転がりKG1a細胞を分析することによって実施された。セルローリングの周波数は、三連で行い、NIS - Elementsシリーズはソフトウェアを使用して分析した。 （*統計学的有意、P &lt;0.001） 生理的なずり応力条件下での内皮細胞の相互作用 - このビデオベースのレポートでは、白​​血球を分析する方法の視覚的描写を提供する。白血球テザリングと転がり、そのようなインテグリンやヒアルロン酸受容体などの受容体を介して二次以上の安定した結合活性の約束のために必要な接着挙動の媒介に、E -セレクチンリガンド - 特に、我々はE -セレクチンの役割を分析した。倒立顕微鏡、ハーバードシリンジポンプ、ビデオカメラとコンピュータ/セル収集ハードウェアとの使用のために適合平行平板フローチャンバーを使用して、我々は、式中、E -セレクチンリガンド+ KG1a細胞は私たちの白血球のモデルとhBMEC細胞（HBMEC -として使用された実験を行った炎症誘発性サイトカイン、IL -1βで刺激60）が、私たちのE -セレクチン+ヒト内皮細胞のモデル（1-6）として使用した。既報の通りKG1aのセルが上を転動と比較して、我々はE -セレクチン依存的にせん断応力レベルの範囲でのIL -1βで刺激したHBMEC - 60細胞（図3）（統計的に有意な差でローリング堅牢KG1a細胞を観察非IL -1β刺激HBMEC - 60細胞）。非IL -1βで刺激したHBMEC - 60細胞やIL -1βで刺激された抗ヒトE -セレクチンモノクローナル抗体で前処理したHBEMC - 60細胞は、依存性を実証するために並行して行われた上でローリングKG1a細胞から成るネガティブコントロール、サイトカインの刺激と圧延活動のためのE -セレクチンの発現（図3）の。コレラ菌で前処理KG1a細胞のさらに、圧延解析はノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）またはブロメライン、表面のE -セレクチン糖タンパク質リガンドを消化するために知られている非特異的プロテアーゼ、とは、E -セレクチンリガンドのために末端シアル酸残基と表面の糖タンパク質の重要性を強調活動（2,3）。

<ol>
	<li>Dimitroff, C. J., Kupper, T. S., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+leukocytic+migration+to+inflamed+skin+with+a+novel+fluorosugar+modifier+of+cutaneous+lymphocyte-associated+antigen.">Prevention of leukocytic migration to inflamed skin with a novel fluorosugar modifier of cutaneous lymphocyte-associated antigen.</a> J. Clin. Invest. 112, 1008-1018 .</li><li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin.">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li><li>Dimitroff, C. J., Descheny, L., Trujillo, N., Kim, R., Nguyen, V., Huang, W., Pienta, K. J., Kutok, J. L., Rubin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+leukocyte+E-selectin+ligands,+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+and+E-selectin+ligand-1,+on+human+metastatic+prostate+tumor+cells.">Identification of leukocyte E-selectin ligands, P-selectin glycoprotein ligand-1 and E-selectin ligand-1, on human metastatic prostate tumor cells.</a> Cancer Res. 65, 5750-5760 (2005).</li><li>Descheny, L., Gainers, M. E., Walcheck, B., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ameliorating+Skin-Homing+Receptors+on+Malignant+T+cells+with+a+Fluorosugar+Analog+of+N-acetylglucosamine:+P-selectin+Ligand+is+a+More+Sensitive+Target+than+E-selectin+Ligand.">Ameliorating Skin-Homing Receptors on Malignant T cells with a Fluorosugar Analog of N-acetylglucosamine: P-selectin Ligand is a More Sensitive Target than E-selectin Ligand.</a> J Invest Dermatol. 126 (9), 2065-2073 (2006).</li><li>Gainers, M. E., Descheny, L., Barthel, S. B., Liu, L., Wurbel, M., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin-homing+receptors+on+effector+leukocytes+are+differentially+sensitive+to+glyco-metabolic+antagonism+in+allergic+contact+dermatitis.">Skin-homing receptors on effector leukocytes are differentially sensitive to glyco-metabolic antagonism in allergic contact dermatitis.</a> J. Immunology. 179 (12), 8509-8518 (2007).</li><li>Rood, P. M., Calafat, J., von dem Borne, A. E., Gerritsen, W. R., van der Schoot, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+human+bone+marrow+endothelial+cells:+characterisation+of+new+cell+lines.">Immortalization of human bone marrow endothelial cells: characterisation of new cell lines.</a> Eur J Clin Invest. 30 (7), 618-629 (2000).</li></ol>

著者らは、関心や開示の競合はありません。

後毛細血管細静脈の表面に付与するもの同様のせん断応力条件下での内皮接着剤の相互作用 - 平行平板フローチャンバーの分析は、白血球の勉強のために使用されるin vitroアッセイ系の専門です。白血球テザリングを媒介し、活性化微小血管内皮細胞の表面上を転動でE -セレクチンリガンド - 私たちの視覚的なプレゼンテーションでここに示すように、我々はE -セレクチンの役割を調べるためにこのシステムの価値を実証。我々はまた、プロテアーゼ、グリコシダーゼとこのシステムのE -セレクチンとそのリガンドの役割を解明するためのブロッキング抗体の治療法の適用を明らかにする。これらの解析は、再現性の高いものであり、E -セレクチン研究するための実験的基礎を形成支援 - in vivoでのE -セレクチンリガンドの機能を。 サイトカイン活性化微小血管内皮細胞（hBMECまたはヒト臍帯静脈や皮膚微小血管内皮細胞）の単層で細胞接着を研究に加えて、アッセイは、組換えヒトE -セレクチンや基板などのE -セレクチン- Igのキメラ分子を精製使用して行うことができます。細胞接着用。白血球を介して仲介他の接着剤の相互作用（L -）-セレクチンと血小板（P）-セレクチンは、平行平板フローチャンバー技術を用いてアッセイすることができます。細胞単層/タンパク質基質のまたは入力白血球/セレクチン-トランスフェクタント細胞モデルの種類を変えることにより、研究者らは生理的せん断ストレス条件下でこれらの相互作用の役割を学ぶことができます。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>F6178-500ML</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5 M EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15575-038</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parallel-Plate Flow Chamber Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GlycoTech</td>
<td>31-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PHD2000 Programmable Syringe Pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>PHD 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35x10mm Tissue Culture Dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD FALCON</td>
<td>353001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fibronectin , from human plasma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>86088-83-7 F2006-2MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Interleukin-1_, Human; Recombinant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>I9401-5UG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS (Hank s Buffered Saline Solution)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>14170</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Medium 199 w/ HEPES & Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12320-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Human Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Innovative Research, Inc.</td>
<td>IPLA-SER1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heparin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abraxis Pharmaceutical Products</td>
<td>504011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Recombinant human fibroblast growth factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&D Systems</td>
<td>233-FB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic Test tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>352008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-human E-selectin clone BBIG-E4(5D11)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&D Systems	</td>
<td>BBA16</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bromelain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>B-4882</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
			<div>
				 	
	

		</div>

analysis of physiologic e-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium

E -セレクチンは、皮膚、骨および炎症組織への白血球の循環の募集を開始役立つ微小血管内皮細胞上の1型膜タンパク質である。 E -セレクチンの発現は、皮膚や骨微小血管で構成的であり、炎症組織における微小血管でのような/ IL -1αとTNF -αなどの炎症性サイトカイン、、によって誘導される。このレクチン受容体が媒介する特徴的なローリング動作につながる循環白血球、上の炭水化物カウンター受容体のリガンドとの弱い結合相互作用を。これらの相互作用がより安定した接着剤のイベントや漏出の活動、白血球のローリング活動の特性評価および白血球E -セレクチンのリガンドの同定に先行するので、白血球の人身売買や炎症の研究で、抗炎症治療薬の開発（1-5）における主要な目標となっている。このレポートの目的は、生理的な血流の条件下で、E -セレクチン、E -セレクチンのリガンドの相互作用を研究するための最も広く使用されている技術の視覚的、包括的な説明を提供することです。ハーバード大学の皮膚病の研究センターと連携して当研究室では、デジタル視覚化し、新たな録音ソフトウェアを伴う最先端の平行平板フローチャンバー装置、NIS - Elementsを使用しています。この技術は、私たちは画面上の可視化だけでなく、ビデオフォーマットで記録圧延活動のためのリアルタイムで接着事象を分析することができます。このようなローリング周波数、せん断抵抗とテザリング/結合効率などの細胞接着のパラメータは、、Excelスプレッドシートにエクスポートして統計分析を受ける、NIS - Elementsシリーズはソフトウェアで計算されます。ここで紹介するデモでは、我々は生きてヒト骨髄内皮細胞（hBMEC）上のE -セレクチン依存性の白血球のローリング活動を調査するために平行平板フローチャンバーを採用。不死hBMEC細胞株、HBMEC - 60細胞は、私たちの内皮細胞のモデル（6）として使用されていたので、E -セレクチンリガンドのハイレベルを発現するヒト造血前駆KG1a細胞は、、、私たちの白血球のモデルとして使用された。フローチャンバーのネイティブE -セレクチンの発現を誘導し、シミュレートするには、HBMEC - 60細胞は、まずIL - 1で活性化した。私たちのビデオプレゼンテーションは、その平行板流れの解析は、プロテアーゼやグリコシダーゼを実装することによって確認できるフローチャンバーに生理的なE -セレクチンを介した白血球のローリング活動と白血球E -セレクチンリガンド（s）のその機能解析を研究するのに適した方法であることを示した消化。

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Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

このレポートでは、生理的ずり応力下で白血球の血管内皮の相互作用を研究するための平行平板フローチャンバーの分析の視覚的描写を提供します。このメソッドは、トリガーの白血球が内皮細胞の表面上を転動すること内皮（E）-セレクチンと白血球E -セレクチンリガンドの役割を調べるために特に有用である。

微小血管内皮上で生理的E -セレクチンを介した白血球のローリングの分析

E-selectin is a type-1 membrane protein on microvascular endothelial cells that helps initiate recruitment of circulating leukocytes to cutaneous, bone ...

analysis-physiologic-e-selectin-mediated-leukocyte-rolling-on

Research

JoVE Journal

Biology

19.0K ビュー.  Brigham and Women's Hospital. このレポートでは、生理的ずり応力下で白血球の血管内皮の相互作用を研究するための平行平板フローチャンバーの分析の視覚的描写を提供します。このメソッドは、トリガーの白血球が内皮細胞の表面上を転動すること内皮（E）-セレクチンと白血球E -セレクチンリガンドの役割を調べるために特に有用である。

ビデオ: Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

生物学

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks in vivo. In this regard, the search for experimental models to build blood vessel networks in vivo is of utmost importance 1. The feasibility of bioengineering microvascular networks in vivo was first shown using human tissue-derived mature endothelial cells (ECs) 2-4; however, such autologous endothelial cells present problems for wide clinical use, because they are difficult to obtain in sufficient quantities and require harvesting from existing vasculature. These limitations have instigated the search for other sources of ECs. The identification of endothelial colony-forming cells (ECFCs) in blood presented an opportunity to non-invasively obtain ECs 5-7. We and other authors have shown that adult and cord blood-derived ECFCs have the capacity to form functional vascular networks in vivo 7-11. Importantly, these studies have also shown that to obtain stable and durable vascular networks, ECFCs require co-implantation with perivascular cells. The assay we describe here illustrates this concept: we show how human cord blood-derived ECFCs can be combined with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as a single cell suspension in a collagen/fibronectin/fibrinogen gel to form a functional human vascular network within 7 days after implantation into an immunodeficient mouse. The presence of human ECFC-lined lumens containing host erythrocytes can be seen throughout the implants indicating not only the formation (de novo) of a vascular network, but also the development of functional anastomoses with the host circulatory system. This murine model of bioengineered human vascular network is ideally suited for studies on the cellular and molecular mechanisms of human vascular network formation and for the development of strategies to vascularize engineered tissues.

Here, we describe a methodology to deliver human cord blood-derived endothelial colony-forming cells (ECFCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), embedded in a collagen/fibronectin gel, subcutaneously into immunodeficient mice. This cell/gel combination generates a human vascular network that connects with the mouse vasculature.

免疫不全マウスにおける生体工学ヒト微小血管ネットワーク

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

RNA-seqのトロンビン処理におけるトランスクリプトームの解析と制御ヒト肺微小血管内皮細胞

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

マウス抵抗動脈から毛細血管内皮の管の隔離

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

外酸生産の測定と解析は、解糖速度を決定するために

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

部位特異的タンパク質のリジンのアセチル化のサクシニル化化学量論組成データに依存しない取得質量分析法による定量

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation of an adaptive immune response. Experimental work with these cells is rather challenging. Their abundance in organs and tissues is relatively low. As a result, they cannot be isolated in large numbers. They are also difficult to transfect with cDNA constructs. In the murine model, these problems can be partially overcome by in vitro differentiation from bone marrow progenitors in the presence of M-CSF for macrophages or GM-CSF for dendritic cells. In this way, it is possible to obtain large amounts of these cells from very few animals. Moreover, bone marrow progenitors can be transduced with retroviral vectors carrying cDNA constructs during early stages of cultivation prior to their differentiation into bone marrow derived dendritic cells and macrophages. Thus, retroviral transduction followed by differentiation in vitro can be used to express various cDNA constructs in these cells. The ability to express ectopic proteins substantially extends the range of experiments that can be performed on these cells, including live cell imaging of fluorescent proteins, tandem purifications for interactome analyses, structure-function analyses, monitoring of cellular functions with biosensors and many others. In this article, we describe a detailed protocol for retroviral transduction of murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages with vectors coding for fluorescently-tagged proteins. On the example of two adaptor proteins, OPAL1 and PSTPIP2, we demonstrate its practical application in flow cytometry and microscopy. We also discuss the advantages and limitations of this approach.

In this article, we provide a detailed protocol for the expression of fluorescent fusion proteins in murine bone marrow derived dendritic cells and macrophages. The method is based on the transduction of bone marrow progenitors with retroviral constructs followed by differentiation into macrophages and dendritic cells in vitro.

マウス骨髄由来の樹状細胞とマクロファージの蛍光融合タンパク質の発現

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

細胞内カルシウムと新鮮な分離とそのままマウス脳血管内皮細胞の膜電位の同時計測

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the most important post-translational modifications in eukaryotic organisms. Ubiquitylation is mediated by a sequential cascade of three enzyme classes including ubiquitin-activating enzymes (E1 enzymes), ubiquitin-conjugating enzymes (E2 enzymes), and ubiquitin ligases (E3 enzymes), and sometimes, ubiquitin-chain elongation factors (E4 enzymes). Here, in vitro protocols for ubiquitylation assays are provided, which allow the assessment of E3 ubiquitin ligase activity, the cooperation between E2-E3 pairs, and substrate selection. Cooperating E2-E3 pairs can be screened by monitoring the generation of free poly-ubiquitin chains and/or auto-ubiquitylation of the E3 ligase. Substrate ubiquitylation is defined by selective binding of the E3 ligase and can be detected by western blotting of the in vitro reaction. Furthermore, an E2~Ub discharge assay is described, which is a useful tool for the direct assessment of functional E2-E3 cooperation. Here, the E3-dependent transfer of ubiquitin is followed from the corresponding E2 enzyme onto free lysine amino acids (mimicking substrate ubiquitylation) or internal lysines of the E3 ligase itself (auto-ubiquitylation). In conclusion, three different in vitro protocols are provided that are fast and easy to perform to address E3 ligase catalytic functionality.

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The present study provides detailed in vitro ubiquitylation assay protocols for the analysis of E3 ubiquitin ligase catalytic activity. Recombinant proteins were expressed using prokaryotic systems such as Escherichia coli culture.

イン・ヴィトロ E3ユビキチンリガーゼ関数の解析

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of inflammation. This phenomenon occurs in postcapillary venules, where blood flow pushes leukocytes in a rolling motion on the endothelial cells. Stable rolling requires a delicate balance between adhesion bond formation and their mechanically-driven dissociation, allowing the cell to remain attached to the surface while rolling in the direction of flow. Unlike other adhesion processes occurring in relatively static environments, rolling adhesion is highly dynamic as the rolling cells travel over thousands of microns at tens of microns per second. Consequently, conventional mechanobiology methods such as traction force microscopy are unsuitable for measuring the individual adhesion events and the associated molecular forces due to the short timescale and high sensitivity required. Here, we describe our latest implementation of the adhesion footprint assay to image the P-selectin: PSGL-1 interactions in rolling adhesion at the molecular level. This method utilizes irreversible DNA-based tension gauge tethers to produce a permanent history of molecular adhesion events in the form of fluorescence tracks. These tracks can be imaged in two ways: (1) stitching together thousands of diffraction-limited images to produce a large field of view, enabling the extraction of adhesion footprint of each rolling cell over thousands of microns in length, (2) performing DNA-PAINT to reconstruct super-resolution images of the fluorescence tracks within a small field of view. In this study, the adhesion footprint assay was used to study HL-60 cells rolling at different shear stresses. In doing so, we were able to image the spatial distribution of the P-selectin: PSGL-1 interaction and gain insight into their molecular forces through fluorescence intensity. Thus, this method provides the groundwork for the quantitative investigation of the various cell-surface interactions involved in rolling adhesion at the molecular level.

This protocol presents the experimental procedures to perform the adhesion footprint assay to image the adhesion events during fast cell rolling adhesion.