この作品は、米国国立がん研究所から国防総省前立腺癌研究プログラム（W81XWH-12-1から0124）の、U54CA143876、ロバートMcCooey泌尿生殖器がん研究基金からの資金によってサポートされていました。私たちは、HUVECをを提供するためのVE-カドヘリン抗体を提供し、博士マルコSeandel（外科）博士Annaritaロレンツォ（病理部）に感謝したいと思います。

観測CTC - 内皮相互作用のためのマイクロスライド上の1。培養のHUVEC <ol><li>組織培養フードの下では、まず、PBSで1mmのチャネル幅をマイクロスライドをすすぐ。優しくコート1ミリリットルルアーロック注射器を用いて50μg/ mlのフィブロネクチン（PBSに溶解）200μlのマイクロスライド。 </li><li>蓋付きのマイクロスライドをカバーし、30分間組織培養フードの中に保管してください。マイクロスライド内の液体の遅い分注は、チャネル内の気泡の形成を防ぐことができます。 </li><li>マイクロスライド上に温かい（37°C）HUVEC増殖培地200μl（M199培地、1M HEPES、20％FBS、5 mg / mlのヘパリン、100μg/ mlの内皮細胞成長因子、及びL-グルタミン）を灌流し、インキュベートRTで20分。灌流中、HUVEC細胞懸濁液を調製。 </li><li> PBSでのHUVECをすすぎ、室温で1〜2分間、0.05％トリプシン-EDTAを追加します。 5分間180×gでの2mlの増殖培地中でHUVECを遠心分離機。 </li><li> neubaを用いて細胞濃度を測定UERの血球計数器および増殖培地μL10 7のHUVEC cells/100を準備します。その後、慎重に200μlのピペットチップを用いてマイクロスライドの入口からメディアを取り出します。 </li><li>目の高さにマイクロスライドを持参し、1 mlのルアーロック注射器を用いて、そっとチャンネルにHUVECの準備濃度の200μLを灌流。注意気泡形成を防ぐために、この段階で必要とされる。気泡が表示された場合、気泡が出口チャネルを入力するまで、わずかにより長い時間灌流キープ。 </li><li>マイクロスライドの入口と出口の両方でのHUVECメディア、等量の（〜80μl）を置く。これは、いずれかの方向における細胞の流れを防止する。 </li><li>スライドをカバーし、1.5時間、インキュベーター（37℃）に保管してください。 </li></ol>ミクロスライド上で一晩HUVEC文化のためのフロー商工総会の2。準備<ol><li> 15マイルのためのインキュベーター内の滅菌20 mlの注射器、メスとオスルアーコネクタ、チューブ、シリンジポンプを配置N。 </li><li>最小限のデッドボリュームの場合は、0.04インチの内径のチューブを使用しています。より小さなチューブ径が気泡形成を防止する。 </li><li>温かい（37℃）、HUVEC培地（12ml）で20 mlの注射器を埋める。注射器の上にコネクタを備えたチューブを取り付けます。気泡を除去する。マイクロスライドにこのアセンブリを接続します。 </li><li>完全HUVEC培地でマイクロスライドの入口を埋める。マイクロスライドの横のコネクタに接続され満たされた20 mlの注射器を持参してください。静かにマイクロスライドにコネクタを取り付けます。 </li><li>インキュベーターにセットアップを持参し、10μL/分のせん断速度に設定したシリンジポンプに接続します。 37℃のインキュベーター内で細胞のO / Nを残す</li><li>次の日、マイクロスライドの入口に取り付けられたコネクタを削除することで、セットアップを分解します。 </li><li> ECの上、E-セレクチンの発現を上方制御するために、4ミリリットルのメディアが10 ng / mlの時に、IL-1βを含む新鮮な増殖培地を準備します。 10 mlの注射器でメディアを吸引除去する。 Tを削除彼マイクロスライドの入口からメディアやスライドにシリンジを接続します。 </li><li>インキュベーター内で4時間10μL/分の剪断速度でシリンジポンプを設定します。 </li></ol> 3。抗PSMAの調製（J591-488）ラベル前立腺癌細胞<ol><li> HUVECのIL-1βのインキュベーションの間、抗PSMA J591-をAlexa488ラベルのPCa細胞を調製。 1分間MDA細胞を0.05％トリプシン-EDTAを追加します。それが細胞表面に存在する糖ペプチドに影響を与えることができるように長い時間のために、トリプシンに細胞を放置しないでください。酵素を含まない細胞解離試薬はまた、代わりに、トリプシンを使用することができる。 5分間200×gで遠心分離する。 </li><li> 1ミリリットルのH / Hバッファー（ハンクスsolution/0.1％HSA/10のHEPES / 1のCaCl 2）でのMDA細胞ペレットを再懸濁します。暗い場所での室温で30分間20μg/ mlの時に抗PSMA J591-のAlexa488抗体を追加します。インキュベーション中に細胞を再懸濁。 </li><li> 30分後、5分間800×gで細胞溶液を遠心する。 ASPIレートと1ミリリットルのH / Hバッファにペレットを再懸濁します。標識されたMDA細胞をカウントし、1×10 6細胞/ mlの最終濃度をもたらす。 J591-488ラベルされたMDA細胞を5 mLの注射器を記入し、気泡を除去。 </li></ol> PCaの患者から4。抗PSMAの調製（J591-488）ラベルのCTCエンリッチ<ol><li> （クエン酸ナトリウムを含有する）は青キャップチューブに前立腺癌患者から7.5ミリリットルの血液を収集する。穏やかに0.1％BSA / 1 mMのEDTA / PBS中の血液1:1に希釈する。 </li><li> 5.3ミリリットルフィコール·パックプラス50mlのコニカルチューブに追加します。層は、フィコール·パックの上に血を希釈した。 30分間400×gで遠心分離する。 </li><li>プレコート全てのチューブまたは先端が2％FBS/RPMI-1640 / 1mMのCaCl 2/4のMgCl 2表面へのCTCの非特異的結合を防ぐために、（R / S緩衝液）を用いたCTCと接触する。 CTCのと接触メディアとバッファの4℃の温度を維持する。 </li><li>末梢血単核細胞（PBMC）を画分を集め30ミリリットルのR / Sバッファを含む別の50 mlのコニカルチューブ内のインタフェースからのCTCを含む。 8分間400×gで遠心分離する。 </li><li>ペレットを再懸濁し、8分間、400×gでR / S緩衝液中で再度洗浄する。遠心分離した後、H / Hバッファーでペレットを再懸濁します。暗い場所での室温で30分間20μg/ mlの時に抗PSMA J591-488抗体を追加します。 </li><li> 30分後、J591-488を含む遠心PBMCを、5分間、800×gでのCTCを標識した。 H / Hのバッファに再懸濁。試料と（R / S緩衝液で予めコーティング）1mlシリンジを充填する。 </li></ol> 5。顕微鏡の準備、シリンジポンプおよびフロー商工総会<ol><li>倒立顕微鏡の電源をオンにして、10倍の対物レンズでケーラー照明を設定します。顕微鏡の試料ステージと同じレベルで、シリンジポンプを持参し、1ダイン/ cm 2のせん断応力（〜10μL/分）で設定してください。 </li><li>ツァイスAxioVisionのソフトウェアを起動します。コンピュータ画面上の目的を選択します。新規作成ソフトウェアの[ツール]オプションの下にあるフォルダ。 </li><li> AxioVisionのスマート実験オプションを開いて、30分間の短い30秒のビデオを記録するために設定を調整します。 </li><li>ライブの蛍光ビデオ、画像オプション-12秒露出、2×2ビン、5ゲインを設定します。これらのパラメータは、ツァイスMRMカメラでビデオのフレームレート（毎秒約23フレーム）に近いビデオを達成するの​​に役立ちます。 </li><li>コンピュータの画面に10のX目的で流路の幅全体を可視化するために、Cマウントアダプター（0.63 xf/60 mmインタフェース）を使用します。 </li><li>水銀ランプのスイッチをオンにします。 </li><li>シリンジとシリンジポンプ上に細胞を含むコネクタを配置します。 </li><li> IL-1βは、インキュベーターからのHUVECを刺激させる。 HUVECをを含むマイクロスライドの塗りつぶされた入口チャネルへのコネクタを接続します。 </li><li>チューブに取り付けられたコネクタと出口チャネルを接続します。フロースルーを収集するために皿または15ミリリットルコニカルチューブにチューブを入れる。 </li><li> infusiを開始10μL/分でマイクロスライドを通して上。内皮細胞間の相互作用を観察し、MDA細胞またはエピ蛍光顕微鏡で488 nmのフィルタの下に患者に由来するラベルのCTCのラベル。 </li><li> 30秒の短いビデオなどの実験の記録を開始。再生分析中に、ローリング速度を測定。圧延速度は、経時的に細胞が移動した距離を割ることによって測定される。 </li></ol>ミクロスライドの6。免疫染色<ol><li> 10分間、IL-1βで刺激したHUVECにMDA細胞を灌流した後にマイクロスライドの入口と出口からメディアを取り出します。 </li><li> （37°C）をPBSで5分間、マイクロスライドの入口にカルシウム及びマグネシウムを含有する200μlのチップを用いて、暖かい置く。ベンチで小道具としての蓋を使用してマイクロスライドを傾けます。免疫染色時に全てのインキュベーションのために傾いた位置にマイクロスライドを保管してください。 </li><li>入口に暖かい、2％ホルムアルデヒドを灌流によってHUVECをを修正しました。 </li><l私は&gt;室温で20分間インキュベートする。 5分間ずつPBSで2回すすいでください。 </li><li> RTで10分間PBS中5％BSAにトリトンX-100（0.1％）を添加する。 </li><li> 5分間ずつPBSで2回すすいでください。 30分間、PBS中の5％BSAでブロックする。 </li><li>一次抗体ヤギ4℃で2.5％のBSA、O / Nでの抗VE-カドヘリン（1:100）でインキュベート</li><li>次の日、5分間ずつPBSで2回洗浄します。 45分間二次ロバ抗ヤギ抗体647を追加します。 5分間ずつPBSで2回洗浄します。 </li><li> 1時間ヒトJ591-のAlexa488結合抗体で、室温でインキュベートする。 </li><li> 5分間ずつPBSで2回洗浄します。 5分間、DAPIを追加します。 5分間蒸留水で洗ってください。 </li><li> PBSを追加する（または長期保存のためのMowiol）。共焦点顕微鏡下でマイクロスライドを可視化する。 </li></ol>

<ol>
	<li>Dimitroff, C. J., Lechpammer, M., Long-Woodward, D., Kutok, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+of+human+bone-metastatic+prostate+tumor+cells+on+human+bone+marrow+endothelium+under+shear+flow+is+mediated+by+E-selectin.">Rolling of human bone-metastatic prostate tumor cells on human bone marrow endothelium under shear flow is mediated by E-selectin.</a> Cancer Res. 64, 5261-5269 (2004).</li><li>Barthel, S. R., Gavino, J. D., Descheny, L., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+selectins+and+selectin+ligands+in+inflammation+and+cancer.">Targeting selectins and selectin ligands in inflammation and cancer.</a> Expert Opin. Ther. Targets. 11, 1473-1491 (2007).</li><li>Konstantopoulos, K., Thomas, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cells+in+transit:+the+vascular+interactions+of+tumor+cells.">Cancer cells in transit: the vascular interactions of tumor cells.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 177-202 (2009).</li><li>Nagrath, S., Sequist, L. V., Maheswaran, S., Bell, D. W., Irimia, D., Ulkus, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rare+circulating+tumour+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology.">Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li><li>Mannweiler, S., Amersdorfer, P., Trajanoski, S., Terrett, J. A., King, D., Mehes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+prostate-specific+membrane+antigen+(PSMA)+expression+in+prostate+carcinoma+with+distant+metastasis.">Heterogeneity of prostate-specific membrane antigen (PSMA) expression in prostate carcinoma with distant metastasis.</a> Pathol. Oncol. Res. 15 (2), 167-172 (2009).</li><li>Tagawa, S. T., Milowsky, M. I., Morris, M. J., Vallabhajosula, S., Christos, P. J., Akhtar, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+study+of+lutetium-177+labeled+anti-prostate-specific+membrane+antigen+(PSMA)+monoclonal+antibody+J591+for+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer.">Phase II study of lutetium-177 labeled anti-prostate-specific membrane antigen (PSMA) monoclonal antibody J591 for metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Cancer Res. , (2013).</li><li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+and+their+use+in+the+study+of+neutrophil+transmigration+under+flow+conditions.">Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions.</a> J. Vis. Exp. (66), 10-3791 (2012).</li><li>Moss, M. A., Zimmer, S., Anderson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+metastatic+potential+in+the+adhesion+of+human+breast+cancer+cells+to+endothelial+monolayers.">Role of metastatic potential in the adhesion of human breast cancer cells to endothelial monolayers.</a> Anticancer Res. 20, 1425-1433 (2000).</li><li>Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+physiologic+E-selectin-mediated+leukocyte+rolling+on+microvascular+endothelium.">Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li><li>Gebauer, F., Wicklein, D., Stubke, K., Nehmann, N., Schmidt, A., Salamon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectin+binding+is+essential+for+peritoneal+carcinomatosis+in+a+xenograft+model+of+human+pancreatic+adenocarcinoma+in+pfp--/rag2--+mice.">Selectin binding is essential for peritoneal carcinomatosis in a xenograft model of human pancreatic adenocarcinoma in pfp--/rag2-- mice.</a> Gut. 62 (5), 741-750 (2013).</li><li>Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rolling+and+adhesion+of+human+tumor+cells+on+vascular+endothelium+under+physiological+flow+conditions.">Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions.</a> J. Clin. Invest. 92 (6), 3038-3044 (1993).</li><li>Remuzzi, A., Giavazzi, R., Dejana, E., Corada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+tumor+cells+under+flow.">Adhesion of tumor cells under flow.</a> Adhesion Protein Protocols. 96, 153-157 (1999).</li><li>Liu, H., Moy, P., Kim, S., Xia, Y., Rajasekaran, A., Navarro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+the+extracellular+domain+of+prostate-specific+membrane+antigen+also+react+with+tumor+vascular+endothelium.">Monoclonal antibodies to the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen also react with tumor vascular endothelium.</a> Cancer Res. 57 (17), 3629-3634 (1997).</li><li>Jung, B., Obinata, H., Galvani, S., Mendelson, K., Ding, B. S., Skoura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-regulated+endothelial+S1P+receptor-1+signaling+sustains+vascular+development.">Flow-regulated endothelial S1P receptor-1 signaling sustains vascular development.</a> Dev. Cell. 23 (3), 600-610 (2012).</li><li>Yin, X., Rana, K., Ponmudi, V., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+fucosyltransferase+III+disrupts+the+adhesion+of+circulating+cancer+cells+to+E-selectin+without+affecting+hematopoietic+cell+adhesion.">Knockdown of fucosyltransferase III disrupts the adhesion of circulating cancer cells to E-selectin without affecting hematopoietic cell adhesion.</a> Carbohydr. Res. 345 (16), 2334-2342 (2010).</li><li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them.">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J Cell Bio. 167 (2), 377-388 (2004).</li></ol>

博士バンダーは、この記事で使用したJ591抗体のためにコーネル研究財団（「CRF」）に割り当てられている特許に関する発明である。博士バンダーはコンサルタントであるMLN-2704の特許は、さらなる研究と開発のためのCRFによってライセンスされていると、会社の株式を所有しています。

による血液細胞の間でのCTCの数が少ないために、それは、細胞の純粋な集団としてのCTCを単離することは困難である。 CTC / ECの相互作用を研究するために、CTCの稀で、不純な人口は、2つの主要な課題提起：血液細胞の間でCTCのa）の特定を; B）CTC / ECの相互作用の観察。 血液細胞のう ​​ち、前立腺のCTCを同定する第一の制限を克服するために、我?...

転移は、ほとんど理解さままで複雑な多段階プロセスである。 E-selectin/selectinリガンド軸は、血管内皮細胞と癌細胞との間の1,2主要接着剤の相互作用を促進することによって腫瘍転移において重要な役割を果たすことが示されている。内皮細胞（E）-セレクチン異なるE-セレクチンリガンド（単数または複数）は、腫瘍細胞3で表されているが、活性化された内皮細胞によって発現される膜貫通タンパク質である。多数のインビトロのアプローチが成功裏に腫瘍細胞および内皮細胞（EC） は1〜E-selectin/selectinリガンド相互作用をモデル化するために使用されてきた。これらの相互作用を研究するために、異なるフローチャンバーシステムは、血管系をシミュレートするために使用されている。フローチャンバーアセンブリの中でも、電気部品と連動して平行プレートフローチャンバー（PPFC）が日常的にインビボせん断応力条件においてシミュレートインビトロモデルとして使用される。この中法のECは35-mmディッシュ上で増殖させ、単層を達成した後、電気部品は、PPFCに取り付けられており、せん断応力ベースの実験を行っている。 しかし、PPFC、その他の現在のシステムは、CTCのは、血液細胞の何百万人の間で循環して、原発腫瘍から脱落、細胞のまれな集団であるため、主に、患者とのECから派生（CTCの）循環腫瘍細胞の間の接着相互作用を研究するために多くの制約を提示（10 9血液細胞あたり1 CTC）4。従って、培養細胞株の無制限の供給とは異なり、低CTCカウントを再生分析のための相互作用を記録するために適切な流路幅を必要とする非常に少数のまれなCTCおよび/ EC相互作用をもたらす。患者派生のCTCが不純な集団であることからさらに、したがって、識別マーカーは、特定の内のCTCを追跡するために必要とされている。この問題を解決するために、我々は、前立腺癌（PCaの）CTを同定する新しい方法を開発Csの実質的にすべてのこれらのCTCのは、それらの細胞表面上で、5,6、前立腺特異的膜抗原（PSMA）を発現するという事実を利用することにより。本稿では、転移のメカニズムを理解するために、最終的には、ECの前立腺のCTCの相互作用を研究するために我々の新しいシステムの潜在的な有用性を実証するために、前立腺癌細胞株、MDA PCA2B（MDA）を使用しました。 私たちの方法論は、生体内血管系7-9 にシミュレートする様々なせん断基づく実験に適用することができます。 PCaのCTC / ECの相互作用を調べることに加えて、現在のフローチャンバーシステムを容易に電気部品で末梢血単核細胞または腫瘍細胞の相互作用を分析するように適合され得る。分解·フローチャンバーの再組み立ての容易さ、（以下、マイクロスライドという）マイクロスライドIII（0.1）は 、灌流の下で培養のECを可能にし、PRを誘導するために種々のサイトカインでのECを刺激otein式。加えて、培養された電気部品、例えば、E-およびP-セレクチン組換えタンパク質は、腫瘍細胞と相互作用し、マイクロスライド上に被覆することができる層流状態10で観察することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="744">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Microslide</td>
			<td style="width:192px;">Ibidi</td>
			<td style="width:119px;">80331</td>
			<td style="width:189px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:192px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Plastic tubing</td>
			<td style="width:192px;">Tygon</td>
			<td style="width:119px;">AAQ04103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Male luer adapter</td>
			<td style="width:192px;">GlycoTech</td>
			<td style="width:119px;">31-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Female luer adapter</td>
			<td style="width:192px;">GlycoTech</td>
			<td style="width:119px;">31-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:192px;">Chemyx Inc</td>
			<td style="width:119px;">Fusion 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Luer-lock syringe</td>
			<td style="width:192px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">M199 medium</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Endothelial Mitogen</td>
			<td style="width:192px;">Biomedical Technologies</td>
			<td style="width:119px;">BT-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">HBSS</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H9269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:244px;">Anti-PSMA J591-488</td>
			<td style="width:192px;">Weill Cornell Medical College-Lab of Urologic Oncology</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Interleukin-1 beta</td>
			<td style="width:192px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Trypsin</td>
			<td style="width:192px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SM-2002-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Heparin</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H-3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:244px;">HUVECs</td>
			<td style="width:192px;">Weill Cornell Medical College-Department of Surgery</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>provided by Marco Seandel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">VE-Cadherin</td>
			<td style="width:192px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">10x objective</td>
			<td style="width:192px;">Zeiss Plan Neofluar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:244px;">Enzyme free cell dissociation reagent</td>
			<td style="width:192px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">S-004-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:192px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-702-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Ficoll-paque plus</td>
			<td style="width:192px;">GE healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
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</table>

in vitro method to observe e-selectin-mediated interactions between prostate circulating tumor cells derived from patients and human endothelial cells

転移は血管外遊出および二ニッチを形成するためのアクセスを取得することにより、腫瘍細胞が原発腫瘍intravasate血液血管およびリンパ系から脱落するプロセスである。血管系からの腫瘍細胞の血管外遊出は、異なる細胞株から得られた内皮細胞（EC）および腫瘍細胞を用いて研究することができる。初期の研究は、静的条件を用いて行ったが、それはウェルのECは生理的流れの条件下では異なる挙動を示すことが実証されている。したがって、異なるフローチャンバアセンブリは、現在のECによる癌細胞の相互作用を研究するために使用されている。電流フローチャンバアセンブリは、異なる剪断応力条件下での異なる細胞株または流体のいずれかを使用して再現性のある結果を提供する。しかしながら、このような循環腫瘍細胞（CTCの）のような希少細胞との相互作用を観察し、研究するために、特定の変更は、従来のフローチャンバアセンブリに行われる必要がある。 CTCの血液細胞数百万人のうち、稀な細胞集団である。これにより、CTCの純粋な集団を得ることは困難である。通常の循環で見られる細胞の異なるタイプのCTCの汚染が存在濃縮または枯渇の技術を使用して避けられない。本報告では、蛍光ラベル、循環前立腺癌細胞に固有の方法を説明し、自己組織化フローチャンバーシステムにおいて、電気部品との相互作用を研究する。この技術はさらに、前立腺のCTCおよび関心対象の任意のタンパク質間の相互作用を観察するために適用することができる。

図1に、マイクロスライド上のECの単分子層のO / N培養を示しています。 図1Aにスケーリングはマイクロスライドの100％が70％の10倍の対物レンズ（ 図1B）を使用して表示されている間に5 ​​倍の対物レンズを使用して表示されていることを示しています。 E-セレクチン介在性相互作用のため、エッジにローリング細胞は録画と再生の分析のためのマイク?...

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In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

我々の報告は、生理的流れの条件下で、前立腺癌においてCTC / ECの相互作用を可視化し、分析するためのユニークな方法を記載する。

患者とヒト内皮細胞に由来する前立腺循環腫瘍細胞との間のE-セレクチン介在性の相互作用を観察するin vitro法での

Metastasis is a process in which tumor cells shed from the primary tumor intravasate blood vascular and lymphatic system, thereby, gaining access to ...

in-vitro-method-to-observe-e-selectin-mediated-interactions-between

Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

9.0K ビュー.  Weill Cornell Medical College. 我々の報告は、生理的流れの条件下で、前立腺癌においてCTC / ECの相互作用を可視化し、分析するためのユニークな方法を記載する。 

ビデオ: In vitro Method to Observe E-selectin-mediated Interactions Between Prostate Circulating Tumor Cells Derived From Patients and Human Endothelial Cells

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

医学

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

CD133の患者由来の細胞培養および分離<sup&gt; +</supメラノーマから&gt;推定されるがん幹細胞

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

ヒト前立腺癌サンプルからがん幹細胞の単離

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with muscular dystrophy is an invaluable cellular source for in&#160;vitro disease model systems and can be used for drug screening studies. Patient-derived urine cells have been used in successful reprogramming into induced pluripotent stem cells in order to model dystrophic cardiomyopathy1. Addressing the safety concerns of integrating vector systems, we present a protocol using a non-integrating Sendai virus vector for transduction of Yamanaka factors into urine cells collected from patients with muscular dystrophy. This protocol generates fully reprogrammed clones within 2&#8211;3 weeks. The pluripotent cells are vector-free by passage-13. These dystrophic iPSCs can be differentiated into cardiomyocytes and used either to study disease mechanisms or for drug screening.

This protocol entails detailed procedures for isolation of urine derived cells from muscular dystrophy patients; their efficient and rapid reprogramming through Sendai virus transduction.

筋ジストロフィー患者から人工多能性幹細胞の生成：尿由来細胞の効率的な統合·フリーリプログラミング

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

卵巣がんの腫瘍開始細胞の体外富化

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

新しい治療戦略を開発するための膵臓癌幹細胞特性を研究

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

マウス癌モデルからの循環腫瘍細胞の単離と伝播

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

腫瘍特異的内皮細胞の単離および培養拡大

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

前立腺癌患者の発生は、循環腫瘍細胞からの異種移植モデルを派生します

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

ヒト腫瘍異種移植片からマウス細胞の枯渇は大幅に標的細胞の下流分析を向上させます

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...