Agradecemos a Mark Terasaki para aconselhamento inicial sobre o uso de um microscópio de dois fótons para criar dano tecidual local, Kathy Joubin para aconselhamento sobre a montagem de lapso de tempo de imagem, e os laboratórios Sagasti e portera-Cailliau para as discussões. Experimentos iniciais foram realizados por AS como Fellow da Fundação grama nos laboratórios de Biologia Marinha de Woods Hole, MA. Trabalho no laboratório Sagasti foi suportada por concessões da Fundação Whitehall, a Fundação Klingenstein, e um Burroughs Wellcome Fund Prémio Carreira em Ciências Biológicas.

Parte 1: embriões zebrafish de montagem para longo prazo imagem <ol><li> Prepare 1% agarose baixo derreta solução para a incorporação. Dissolver a agarose em água DI por aquecimento em um forno de microondas, alíquota em pequenos tubos e armazenar em um bloco de aquecimento a 42 graus Celsius. </li><li> Selecionar embriões para geração de imagens e remover seus córions puxando o córion distante com fórceps. Embriões podem ser colocados em uma solução de 5% Ringers PTU em 22-24 horas após a fertilização (hpf) para inibir a formação de pigmento. Isso melhora a clareza de imagem e é essencial para a realização de dois fótons axotomies dos axônios sensitivos. Se o pigmento natural é permitida a forma, obscurece autofluorescência axônios no microscópio de dois fotões. Ringers solução para zebrafish contém 116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, e HEPES 5mM, pH 7,2. </li><li> Anestesiar embriões adicionando ~ tricaina 0,02% ao Ringers PTU. Fazer animais com certeza não são sensíveis a toque antes de prosseguir. </li><li> Prepare a câmara de imagem a longo prazo através da aplicação de graxa de vácuo para um dos lados de um anel de vidro ou teflon e fixá-la em uma lamínula de vidro. </li><li> Transferência de um embrião para a solução de agarose 42 graus com uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não transferir a maior parte do Ringers PTU, em seguida, transferir o embrião com uma gota de agarose para uma lamínula preparado. </li><li> Posição do embrião como desejado como a agarose endurece. Tenha em mente que a câmara de imagem será invertido quando você está feito para que a lamínula será a superfície superior. </li><li> Se você tem um estágio motorizado e pode locais de várias imagens de uma vez, repita os passos de 1,4-1,6 para cada embrião. </li><li> Permitir que a agarose completamente solidificar, em seguida, preencher o anel com 0,02% tricaina PTU Ringers. </li><li> Aplique graxa de vácuo para o outro lado do ringue (s), em seguida, cobrir o anel (s) com uma lâmina de vidro. Virar a câmara selada (s) mais. Estas câmaras podem ser usados ​​para geração de imagens em microscópios vertical ou invertida. </li></ol> Parte 2: Dois fótons axotomia usando um personalizado construído microscópio de dois fótons com um Ti-Safira Chameleon a laser <ol><li> Prepare-se para imagens. Coloque o embrião montado (s) em um compartimento de slides, sob o microscópio. Concentre-se em um embrião com o objectivo de água 40X (0.8 NA). Ligue o laser. Temos sido capazes de visualizar e reproduzível danos GFP expressar neurônios utilizando os seguintes parâmetros. Para visualizar os axônios de um poder não-prejudiciais, definir a laser para um comprimento de onda de 910 nanômetros (nm) e uma potência de 30 miliwatts (mW listados são a quantidade de energia na amostra). Abra o software de imagem. Nós usamos Software scanimage desenvolvido em laboratório Karel Svoboda 2, 3. </li><li> Pressione o foco para a varredura do embrião com o laser de dois fótons, localize o axônio que deseja axotomize, e capturar uma imagem do axônio. Marcar a primeira ea última posições Z, adquirir a imagem, e fazer uma projeção máxima das pilhas Z. </li><li> Zoom em 70X no ramo do axônio que deseja axotomize e interromper a digitalização. Aumentar o mW na amostra para o poder de causar dano de 180 mW, e realizar um único exame com o laser. Fazemos isso definindo o número de fatias Z a 1 e pressionando &quot;Grab&quot;. Isso deve ser suficiente para romper o axônio. Veja a discussão de métodos para otimizar este procedimento para o seu microscópio e objetivo experimental. </li><li> Diminuir o zoom, reduzir o poder de 30 mW e ter uma imagem. </li></ol> Parte 3: Two-photon axotomia em microscópio confocal Zeiss 510 / dois fótons <ol><li> Lugar montado embrião para o palco e trazê-lo em foco utilizando objetiva de 25X de água ou objetivo adequado. </li><li> Ligue a dois fótons (910 nm) e argônio (488 nm) lasers em um ambiente multi-track de modo que é possível mudar de um para o outro. Embora ambos os lasers são usados ​​para detectar GFP, a emissão de dois fótons é visualizado com o vermelho, eo argônio emissão laser com verde para diferenciar os dois. </li><li> Use o laser de argônio para identificar um axônio para ferir. Sob Z configurações marcar a primeira ea última seções ópticas. Pegue uma imagem confocal e criar uma projeção máxima da pilha Z. </li><li> Escolha a região do axônio de ser ferido e trazer esta região em foco. Desligue o laser de argônio e ligue o laser de dois fótons. Varredura da amostra com os dois fótons de laser em uma intensidade de aproximadamente 9% de transmissão para se certificar de que o axônio ainda está em foco. </li><li> Clique no botão &quot;stop&quot; para que a ferramenta de corte estarão disponíveis. Use cultura para ampliar a área de interesse. Geralmente nós zoom para ~ 70X (zoom pode ser verificada com o &quot;modo&quot; tab). Sob a &quot;canais&quot; guia alterar a intensidade dos dois fótons de transmissão ~ 9% para a transmissão de 15-20%. </li><li> Para cortar um axônio ativar o &quot;fast XY&quot; botão por cerca de 1 segundo e pressione o botão Parar para evitar danos em excesso. O axônio deve ser visto como destroços espalhados se o procedimento funcionou. </li><li> Para garantir que o axôniofoi danificado voltar para a 488 nm laser de argônio, tomar outra imagem confocal, e criar uma projeção máxima. </li></ol> Parte 4: imagens de lapso de tempo em Confocal Zeiss LSM 510 <ol><li> Prepare-se para imagens. Se você estiver usando uma fase aquecida, certifique-se de transformá-lo em pelo menos 30 minutos antes de montar seu filme de lapso de tempo. Coloque o embrião montado (s) em um compartimento de slides, sob o microscópio. Concentre-se em um embrião com o objectivo de ar desejado. Nós usamos um 20X, 0,5 objetivo NA. Abra Zeiss LSM 510 software de imagem. Ligue a lasers adequadas e criar a configuração desejada. Vamos agora descrever um protocolo detalhado para a imagem a longo prazo com software Zeiss LSM Tempo Multi. Estes métodos podem ser adaptados para uso em seu próprio microscópio com o seu software de imagem. </li><li> Definir a posição e configuração do seu primeiro embrião na janela Tempo Multi. Abra o scan, palco, e as janelas Tempo Multi. Ativar rápida varredura na janela de digitalização. Mover o palco para a posição desejada XY. Marcar a primeira ea última posições Z na janela de digitalização. Pressione parar, então Mid, também na janela de digitalização. Aguarde o scan da fatia Z meio para terminar, pressione posição da marca na janela palco. Se você é apenas um embrião de imagens, clique no &quot;Single Location&quot; tab na janela Tempo Multi. Clique em &quot;Replace XYZ&quot; e depois em &quot;Save Configuration&quot;. Concordo quando solicitado a substituir a configuração anterior. Avance para o passo 4.4. Se você tem um estágio mecanizada, você pode configurar vários locais para embriões de várias imagens. Neste caso, você deve selecionar o &quot;Multiple Locations&quot; guia antes de definir o XYZ e configuração para a sua localização em primeiro lugar. Além disso, certifique-se que o menu pull-down logo abaixo da &quot;Multiple Locations&quot; guia é sobre a localização 1, e que o menu suspenso na seção de configuração diz vários loc 1, antes de clicar em salvar a configuração. </li><li> Definir a posição e configuração de seus embriões restantes na janela Tempo Multi. Localize o seu embrião que vem, em seguida, pressione scan rápido, mova o estágio na posição XY desejado e marcar a sua primeira e última posições Z na janela de digitalização. Pressione parar, então Mid, também na janela de digitalização. Aguarde o scan da fatia Z meio para terminar, pressione posição da marca na janela palco. Clique em &quot;Replace XYZ&quot;. Verifique se o menu pull-down logo abaixo da &quot;Multiple Locations&quot; guia é sobre a localização 2, e que o menu suspenso na seção de configuração diz loc múltiplos 2, em seguida, clique em &quot;Save Configuration&quot;. Concordo quando solicitado a substituir a configuração anterior. Repita esse processo para os embriões restantes. </li><li> Configurar os parâmetros para aquisição de imagem na janela do Multi-Loc. Escolha a opção GL-GR na &quot;Lista de Blocos&quot; seção, em seguida, digite o número desejado de repetições grupo. Este é o número de vezes que o confocal irá adquirir uma imagem em cada local. Digite o intervalo de espera desejado na seção Parâmetros. Esta é a quantidade de tempo desde o início de uma repetição de imagens para o início da próxima repetição. Selecione &quot;ZStackXY&quot; na seção de configuração. Digite o nome do arquivo de base na seção inferior. Clique em &quot;DB Selecionar Imagem&quot; e escolha o seu mdb. Clique no botão &quot;Opções&quot;. Selecione a pasta para salvar arquivos mdb temp. Marque a opção &quot;manter a imagem final aberta&quot;, &quot;salvar imagem final&quot;, e &quot;meio da pilha z&quot;. Selecione esperar intervalo. Clique em OK para fechar a janela de opções. Clique em &quot;hora de início&quot;. Deixe a janela aberta multi Tempo de duração das imagens. </li><li> Analisar seus dados. Quando a imagem de lapso de tempo tenha terminado, o software multi Tempo irá compilar todos os seus arquivos temporários em um arquivo de resumo para cada local. Se você quiser parar o filme antes de ser concluída, não se esqueça de pressionar &quot;Finish&quot; em vez de &quot;Stop&quot;, de modo que um arquivo de resumo será criado. Os arquivos temporários e arquivos de resumo deve ser automaticamente salvo na pasta mdb designado. No menu software LSM, clique em &quot;Ver 3D&quot;, então &quot;Projecção&quot;. Com o seu arquivo de resumo selecionado no menu suspenso, clique em &quot;Apply&quot;. Isso irá gerar projeções máxima da pilha de Z para cada imagem confocal. No menu software LSM, clique em &quot;Arquivo&quot;, depois em &quot;Export&quot;. Salve o máximo projeções como uma série de arquivos tif. Você pode então criar um filme fora da série de tif usando ImageJ ou QuickTime Pro. Axônios nas imagens LSM pode ser rastreada em três dimensões usando software de análise de imagem (por exemplo, NeuroLucida de MicroBrightfield) para gerar informações quantitativas detalhadas sobre a morfologia do axônio. </li></ol> Parte 5: Os resultados representativos A experiência bem sucedida irá resultar em uma representação precisa da dinâmica celulars de axônio recuperação da lesão. Seu embriões será saudável após imagem, sem degeneração visível e uma batida de coração forte. A axotomia deve resultar em danos preciso, só cortando o ramo definido do axônio. Não deve haver prejuízo para os axônios circundante e morte celular mínima. Acreditamos que vemos a morte de uma única célula epidérmica diretamente sobre o local da axotomia em ~ 50% dos experimentos. Se você observar mais dano, você deve otimizar o protocolo de dois fótons, como descrito na discussão.

<ol>
	<li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors.">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Sacconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons.">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li><li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li><li>Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+laser+cellular+microsurgery.">Mechanisms of laser cellular microsurgery.</a> Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).</li></ol>

Nós temos usado os métodos descritos com precisão axotomize periféricos axônios sensitivos e observar diretamente a regeneração no embrião do zebrafish vida. Longo prazo de imagens de lapso de tempo confocal em zebrafish pode ser usado para observar muitos processos de desenvolvimento in vivo. O procedimento axotomia dois fótons descritos podem ser modificadas para muitos diferentes objetivos experimentais. Temos usado o mesmo procedimento geral para extirpar toda trigeminal corpos celulares dos neurô...

two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Peixe-zebra tem sido utilizada para estudar os mecanismos celulares e moleculares do desenvolvimento por lapso de tempo de imagem do embrião vivo transparente. Aqui nós descrevemos um método para montar embriões zebrafish de longo prazo de imagem e demonstrar como automatizar a captura de imagens de lapso de tempo usando um microscópio confocal. Descrevemos também um método para criar danos, controlado precisa para ramos individuais de axônios sensitivos periféricos em zebrafish usando o poder concentrado de um laser de femtosegundos montado em um microscópio de dois fotões. Os parâmetros para axotomia dois fótons de sucesso deve ser otimizada para cada microscópio. Vamos demonstrar dois fótons axotomia em ambos um costume construída microscópio de dois fótons e uma Zeiss 510 / confocal de dois fótons para fornecer dois exemplos. Zebrafish trigeminal neurônios sensoriais podem ser visualizados em uma linha de transgênicos expressando GFP dirigido por um promotor neurônio sensorial específica 1. Nós adaptamos este modelo zebrafish trigeminal para observar diretamente a regeneração do axônio sensorial em que vivem os embriões do zebrafish. Embriões são anestesiados com tricaina e posicionado dentro de uma gota de agarose como ela se solidifica. Embriões imobilizado são selados dentro de uma câmara de imagem cheia de phenylthiourea (PTU) Ringers. Nós descobrimos que os embriões podem ser continuamente trabalhada, nas câmaras de 12-48 horas. A única imagem confocal é então capturado para determinar o local desejado para a axotomia. A região de interesse está localizado no microscópio de dois fotões por imagem os axônios sensoriais em baixa, o poder não-prejudicial. Depois de ampliar no local desejado de axotomia, a potência é aumentada e uma única varredura da região definida é suficiente para romper o axônio. Múltiplas localização de imagens de lapso de tempo é então configurado em um microscópio confocal para observar diretamente a recuperação de uma lesão axonal.

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Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Aqui nós descrevemos um método para a montagem de embriões zebrafish de longo prazo de imagem, de dois fótons de imagem e tecidos de danos técnicas e lapso de tempo de imagem confocal.

Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

two-photon-axotomy-time-lapse-confocal-imaging-live-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K visualizações.  University of California, Los Angeles. Aqui nós descrevemos um método para a montagem de embriões zebrafish de longo prazo de imagem, de dois fótons de imagem e tecidos de danos técnicas e lapso de tempo de imagem confocal.

Vídeo: Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biologia

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Two-Photon-Based fotoativação no Live Embriões Zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Transplante de GFP-expressando Blastômeros for Imaging ao vivo de Desenvolvimento da retina e do cérebro em embriões Zebrafish Quimérico

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

Multicolor imagem em tempo-lapso de Transgênicos Zebrafish: Visualizando Células-Tronco da retina Ativado por Ablação célula-alvo Neuronal

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

Uso de Microscopia Time Lapse para Visualize Anoxia induzida Suspended Animation em<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriões

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Longo prazo, de alta resolução de imagem Lapse Confocal Tempo de<em&gt; Cotilédone Arabidopsis</em&gt; Epiderme durante a germinação

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...