Ringraziamo Segna Terasaki per la consulenza iniziale utilizzando un microscopio a due fotoni per creare danni del tessuto locale, Kathy Joubin per un consiglio su montaggio per time-lapse imaging, ed i laboratori Sagasti e Portera-Cailliau per le discussioni. Le prime esperienze sono state eseguite da AS come Fellow Grass Fondazione presso i laboratori di biologia marina di Woods Hole, Massachusetts. Lavoro in laboratorio Sagasti è stato supportato anche da finanziamenti della Fondazione Whitehall, la Fondazione Klingenstein, e un Premio alla Carriera Burroughs Wellcome Fondo in Scienze Biologiche.

Parte 1: embrioni di zebrafish di montaggio a lungo termine di imaging <ol><li> Preparare 1% bassa temperatura di fusione soluzione di agarosio per l&#39;incorporamento. Sciogliere agarosio in acqua deionizzata da riscaldamento in un forno a microonde, aliquota in tubi piccoli e conservare in un blocco di riscaldamento a 42 gradi Celsius. </li><li> Selezionare gli embrioni per l&#39;imaging e rimuovere la loro chorions tirando delicatamente il corion a parte con una pinza. Gli embrioni possono essere inseriti in una soluzione al 5% PTU Ringers a 22-24 ore dopo la fecondazione (HPF) di inibire la formazione di pigmento. Ciò migliora la chiarezza delle immagini ed è essenziale per l&#39;esecuzione di due fotoni axotomies degli assoni sensitivi. Se il pigmento naturale è consentito di formare, autofluorescenza oscura assoni sul microscopio a due fotoni. Suonerie soluzione per zebrafish contiene 116 mm NaCl, 2.9 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2 e HEPES 5mm, pH 7,2. </li><li> Anestetizzare gli embrioni con l&#39;aggiunta di ~ 0,02% tricaine al Ringers PTU. Assicurarsi che gli animali non sono sensibili al tatto prima di procedere. </li><li> Preparare a lungo termine della camera di imaging mediante l&#39;applicazione di grasso per vuoto ad un lato di un anello in vetro o in teflon e fissaggio su un vetrino di vetro. </li><li> Trasferimento di un embrione nella soluzione di 42 gradi agarosio con una pipetta di vetro, facendo attenzione a non trasferire gran parte del Ringers PTU, poi trasferire l&#39;embrione con una goccia di agarosio su un vetrino preparato. </li><li> Posizionare l&#39;embrione come desiderato come l&#39;agarosio si indurisce. Tenete presente che la camera di imaging saranno invertite quando si è fatto in modo che la polizza di copertura sarà la superficie superiore. </li><li> Se si dispone di uno stadio motorizzato e può posizioni più immagini in una sola volta, ripetere i passaggi 1,4-1,6 per ogni embrione. </li><li> Lasciare che il agarosio solidificare completamente, quindi riempire l&#39;anello con il 0,02% tricaine Ringers PTU. </li><li> Ingrassare vuoto dall&#39;altra parte del ring (s), quindi coprire l&#39;anello (s) con una lastra di vetro. Capovolgere la camera stagna (s) finita. Queste camere possono essere utilizzate per l&#39;imaging su microscopi diritta o capovolta. </li></ol> Parte 2: due fotoni assotomia utilizzando un custom microscopio a due fotoni con un Ti-Sapphire Chameleon laser <ol><li> Prepararsi per l&#39;imaging. Posizionare l&#39;embrione (s) montati su un supporto per diapositive sotto il microscopio. Focus su un embrione con un 40X (0,8 NA) obiettivo di acqua. Accendere il laser. Siamo stati in grado di visualizzare in modo riproducibile e danneggiare i neuroni che esprimono GFP utilizzando i seguenti parametri. Per visualizzare gli assoni a non danneggiare il potere, di laser a una lunghezza d&#39;onda di 910 nanometri (nm) e una potenza di 30 milliwatt (mW elencati sono la quantità di potenza del campione). Aprire il software di imaging. Noi utilizziamo software scanimage sviluppato nel laboratorio di Karel Svoboda 2, 3. </li><li> Premere il fuoco per eseguire la scansione l&#39;embrione con il laser a due fotoni, individuare l&#39;assone si desidera axotomize, e catturare un&#39;immagine di questo assone. Segnare le posizioni prima e l&#39;ultima Z, acquisire l&#39;immagine, e fare una sporgenza massima delle pile Z. </li><li> Zoom 70X sul ramo del assone si desidera axotomize e interrompere la scansione. Aumentare la mW a campione per il potenziale nocivo di 180 mW, ed eseguire una singola scansione con il laser. Facciamo questo impostando il numero di fette Z a 1 e premendo &quot;Grab&quot;. Questo dovrebbe essere sufficiente per tagliare l&#39;assone. Si veda la discussione di metodi per ottimizzare questa procedura per il microscopio e l&#39;obiettivo sperimentale. </li><li> Ridurre, ridurre la potenza a 30 mW e scattare una foto. </li></ol> Parte 3: a due fotoni assotomia il microscopio confocale Zeiss 510 / a due fotoni <ol><li> Luogo embrione montato sul palco e portarlo a fuoco con un obiettivo 25X acqua o altro obiettivo adeguato. </li><li> Accendere i due fotoni (910 nm) e argon (488 nm) in un ambiente multi-traccia in modo che sia possibile passare da uno all&#39;altro. Sebbene entrambi i laser sono utilizzati per rilevare GFP, i due fotoni emissione viene visualizzata con il rosso e l&#39;emissione argon laser verde per differenziare i due. </li><li> Usare il laser ad argon per identificare un assone a ferire. Sotto Z impostazioni segnare le sezioni prima e l&#39;ultima ottica. Prendete un immagine confocale e di creare una proiezione massima dello stack Z. </li><li> Scegli la regione dell&#39;assone di essere feriti e portare questa regione a fuoco. Spegnere il laser Argon e accendere i due fotoni del laser. Scansione del campione con i due fotoni ad una intensità del laser di trasmissione ~ 9% per assicurarsi che l&#39;assone è ancora a fuoco. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;stop&quot; in modo che lo strumento di ritaglio sarà disponibile. Dell&#39;uso delle colture per ingrandire l&#39;area di interesse. Di solito ci zoom ~ 70X (zoom può essere verificato sotto la scheda &quot;modalità&quot;). Nella scheda &quot;canali&quot; modificare l&#39;intensità dei due fotoni dalla trasmissione ~ 9% al 15-20% di trasmissione. </li><li> Per tagliare un assone attivare il &quot;fast XY&quot; pulsante per circa 1 secondo e quindi premere il pulsante di arresto per evitare danni in eccesso. L&#39;assone dovrebbe essere visto come detriti sparsi se la procedura ha funzionato. </li><li> Per garantire che l&#39;assoneè stato danneggiato tornare al 488 nm Argon laser, prendere un&#39;altra immagine confocale, e creare una proiezione massima. </li></ol> Parte 4: confocale time-lapse imaging Zeiss LSM 510 <ol><li> Prepararsi per l&#39;imaging. Se si utilizza uno stadio riscaldato, assicurarsi di accenderlo almeno 30 minuti prima di configurare il time-lapse film. Posizionare l&#39;embrione (s) montati su un supporto per diapositive sotto il microscopio. Focus su un embrione con l&#39;obiettivo d&#39;aria desiderato. Usiamo un 20X, 0,5 obiettivo NA. Aprire Zeiss LSM 510 software di imaging. Accendere il laser appropriato e impostare la configurazione desiderata. Noi ora descrivere un protocollo dettagliato per l&#39;imaging a lungo termine con il software Zeiss LSM Tempo Multi. Questi metodi possono essere adattati per essere utilizzati sul vostro microscopio proprio con il software di imaging. </li><li> Definire la posizione e la configurazione del vostro primo embrione nella finestra di tempo Multi. Aprire la scansione, lo stadio, e le finestre Tempo Multi. Attivare rapidamente la scansione nella finestra di scansione. Spostare lo stadio fino alla posizione XY desiderata. Segnare le posizioni prima e l&#39;ultima Z nella finestra di scansione. Premere stop, poi media, anche nella finestra di scansione. Attendere che la scansione della fetta centrale Z per finire, quindi premere posizione marchio nella finestra palco. Se siete solo un embrione di imaging, clicca sul &quot;Single Location&quot; scheda nella finestra Tempo Multi. Clicca su &quot;Sostituisci XYZ&quot; e poi su &quot;Save Configuration&quot;. D&#39;accordo quando gli viene chiesto di sovrascrivere la configurazione precedente. Passare al punto 4.4. Se si dispone di un palcoscenico meccanizzato, è possibile impostare diverse posizioni di embrioni immagini multiple. In questo caso, è necessario selezionare il &quot;Multiple Locations&quot; scheda prima di definire la XYZ e la configurazione per la vostra prima posizione. Inoltre, assicurarsi che il menu a tendina appena sotto il &quot;Multiple Locations&quot; scheda è in posizione 1, e che il menu a tendina nella sezione di configurazione dice più loc 1, prima di fare clic su Salva configurazione. </li><li> Definire la posizione e la configurazione del vostro embrioni rimanenti nella finestra di tempo Multi. Individuare l&#39;embrione successivo, quindi premere veloce scansione, spostare lo stage nella posizione desiderata XY, e segnare le posizioni prima e l&#39;ultima Z nella finestra di scansione. Premere stop, poi media, anche nella finestra di scansione. Attendere che la scansione della fetta centrale Z per finire, quindi premere posizione marchio nella finestra palco. Clicca su &quot;Sostituisci XYZ&quot;. Verificare che il menu a tendina appena sotto il &quot;Multiple Locations&quot; scheda è in posizione 2, e che il menu a tendina nella sezione di configurazione dice più loc 2, quindi fare clic su &quot;Salva configurazione&quot;. D&#39;accordo quando gli viene chiesto di sovrascrivere la configurazione precedente. Ripetere la procedura per gli embrioni rimanenti. </li><li> Impostare i parametri per l&#39;acquisizione delle immagini nella finestra Multi Loc. Scegli la GR-GL opzione nella sezione &quot;Elenco delle Blocchi&quot;, quindi immettere il numero desiderato di ripetizioni di gruppo. Questo è il numero di volte che il confocale acquisirà l&#39;immagine in ogni sede. Inserire l&#39;intervallo di attesa desiderato nella sezione Parametri. Questa è la quantità di tempo dall&#39;inizio di una ripetizione di imaging per l&#39;inizio della ripetizione successiva. Selezionare &quot;ZStackXY&quot; nella sezione di configurazione. Inserisci il tuo nome base del file nella sezione inferiore. Clicca su &quot;DB Seleziona immagine&quot; e scegli il tuo mdb. Fare clic sul pulsante &quot;Opzioni&quot;. Selezionare la cartella mdb per salvare i file temporanei. Check &quot;tenere immagine finale aperto&quot;, &quot;salva immagine finale&quot;, e &quot;mezzo della pila z&quot;. Seleziona aspettare intervallo. Fare clic su OK per chiudere la finestra delle opzioni. Clicca su &quot;Start Time&quot;. Lascia finestra Tempo Multi aperta per la durata di imaging. </li><li> Analizzare i dati. Quando il time-lapse imaging ha finito, il software Multi Ora compila tutti i file temporanei in un file di riepilogo per ogni località. Se si desidera interrompere il film prima che sia completa, assicurarsi di premere il tasto &quot;Fine&quot; invece di &quot;Stop&quot;, in modo che un file di riepilogo verrà creato. I file temporanei e file di sintesi deve essere salvato automaticamente nella cartella mdb designata. Dal menu del software LSM, clicca su &quot;View 3D&quot;, poi &quot;proiezione&quot;. Con il vostro file di riepilogo selezionata nel menu a discesa, fare clic su &quot;Applica&quot;. Questo genererà proiezioni massima dello stack Z per ogni immagine confocale. Nel menu del software LSM, cliccare su &quot;File&quot;, poi &quot;Esporta&quot;. Salva le proiezioni al massimo come una serie di file con estensione tif. Si può quindi creare un film della serie di file tif utilizzando ImageJ o QuickTime Pro. Assoni nelle immagini LSM può essere rintracciata in tre dimensioni utilizzando software di analisi dell&#39;immagine (per esempio NeuroLucida da MicroBrightfield) per generare dettagliate informazioni quantitative sulla morfologia degli assoni. </li></ol> Parte 5: risultati Rappresentante Un esperimento riuscito si tradurrà in una rappresentazione accurata della dinamica cellulares di recupero degli assoni da un infortunio. Il tuo embrioni saranno sani dopo l&#39;imaging, senza degenerazione visibile e un battito cardiaco forte. Il assotomia dovrebbe causare danni preciso, solo tagliando il ramo definito dell&#39;assone. Non dovrebbero esserci lesioni al assoni circostante e la morte delle cellule minime. Noi crediamo di vedere la morte di una singola cellula epidermica direttamente sul sito di assotomia in ~ 50% degli esperimenti. Se si osservano più danni, si dovrebbe ottimizzare le due fotoni protocollo, come descritto nella discussione.

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	<li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors.">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Sacconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons.">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li><li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li><li>Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+laser+cellular+microsurgery.">Mechanisms of laser cellular microsurgery.</a> Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).</li></ol>

Abbiamo usato i metodi descritti per axotomize proprio assoni periferici sensoriali e di osservare direttamente la rigenerazione di un embrione in zebrafish vivente. A lungo termine time-lapse confocale in zebrafish può essere usato per osservare molti processi di sviluppo in vivo. I due fotoni assotomia procedura descritta può essere modificata per molti scopi diversi sperimentali. Abbiamo usato la stessa procedura generale per l&#39;ablazione intero trigemino corpi cellulari dei neuroni sensoriali, con lo z...

two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish sono stati a lungo utilizzato per studiare i meccanismi cellulari e molecolari di sviluppo da parte time-lapse imaging del embrione vivente trasparente. Qui si descrive un metodo per montare embrioni di zebrafish a lungo termine di imaging e di dimostrare come automatizzare la cattura di time-lapse immagini utilizzando un microscopio confocale. Abbiamo anche descrivere un metodo per creare controllato e preciso per i danni di singoli rami periferici assoni sensoriali in zebrafish utilizzando la potenza concentrata di un laser a femtosecondi montato su un microscopio a due fotoni. I parametri per il successo a due fotoni assotomia deve essere ottimizzato per ogni microscopio. Dimostreremo a due fotoni assotomia sia su un personalizzato costruito a due fotoni e un microscopio Zeiss 510 / confocale a due fotoni per fornire due esempi. Zebrafish neuroni sensoriali del trigemino possono essere visualizzati in una linea transgenici che esprimono GFP guidata da un promotore dei neuroni sensoriali specifici 1. Abbiamo adattato questo modello zebrafish trigemino di osservare direttamente la rigenerazione degli assoni sensitivi in ​​vita embrioni di zebrafish. Embrioni sono anestetizzati con tricaine e posizionato all&#39;interno di una goccia di agarosio come si solidifica. Embrioni immobilizzati sono sigillati all&#39;interno di una camera piena di immagini phenylthiourea (PTU) suonerie. Abbiamo scoperto che gli embrioni possono essere continuamente ripreso in queste camere per 12-48 ore. Una singola immagine confocale viene poi catturato per determinare il sito desiderato assotomia. La regione di interesse si trova sul microscopio a due fotoni per immagini gli assoni sensoriali in basso, che non infligge danno potere. Dopo lo zoom sul sito desiderato assotomia, la potenza è aumentata e una singola scansione di quella regione definita è sufficiente per recidere l&#39;assone. Multiple location time-lapse imaging è quindi impostare su un microscopio confocale per osservare direttamente il recupero da un infortunio assonale.

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Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Qui si descrive un metodo per il montaggio di embrioni di zebrafish a lungo termine di imaging, due fotoni imaging e tessuti danni tecniche, e time-lapse confocale.

Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

two-photon-axotomy-time-lapse-confocal-imaging-live-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Views.  University of California, Los Angeles. Qui si descrive un metodo per il montaggio di embrioni di zebrafish a lungo termine di imaging, due fotoni imaging e tessuti danni tecniche, e time-lapse confocale.

Video: Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivere Imaging of the Brain Zebrafish embrionali da microscopia confocale

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Ricerca

Biologia

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Immagini dal vivo della motilità cellulare e citoscheletro dei singoli neuroni e cellule della cresta neurale in embrioni di zebrafish

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

Il trapianto di GFP che esprimono blastomeri per dell&#39;immagine in tempo reale dello sviluppo della retina e del cervello in embrioni di zebrafish Chimerico

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

Multicolor time-lapse imaging di transgenici Zebrafish: Visualizzare cellule staminali della retina Attivato da mirata ablazione delle cellule neuronali

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Microscopia time-lapse di Embriogenesi All&#39;inizio del Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

L&#39;uso della microscopia Time lapse di visualizzare anossia indotta Suspended Animation in<em&gt; C. elegans</em&gt; Embrioni

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

A lungo termine, ad alta risoluzione confocale Lapse Imaging Tempo di<em&gt; Cotyledon Arabidopsis</emEpidermide&gt; durante la germinazione

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Methods Article

Due fotoni assotomia e time-lapse confocale in embrioni di zebrafish vivo