אנו מודים סמן Terasaki לייעוץ ראשוני באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים ליצור נזק לרקמות מקומיות, קתי Joubin עצה על הרכבה הדמיה זמן לשגות, לבין Sagasti ו-Portera Cailliau מעבדות לדיונים. הניסויים הראשוניים בוצעו על ידי AS כמו עמית גראס קרן במעבדות לביולוגיה ימית בוודס הול, מסצ&#39;וסטס. עבודה במעבדה Sagasti נתמך על ידי מענקים מקרן וייטהול, קרן Klingenstein, וכן פרס קרן Wellcome בורוז קריירה במדעי הביולוגיה.

חלק 1: עוברי דג הזברה הרכבה הדמיה לטווח ארוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1% נמוך פתרון להמיס agarose להטבעת. ממיסים agarose במים DI על ידי חימום במיקרוגל, aliquot לתוך צינורות קטנים חנות בתוך גוש חימום על 42 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עוברים הדמיה ולהסיר chorions שלהם על ידי משיכתו בעדינות סיסית בנפרד עם מלקחיים. עוברים ניתן להציב לתוך פתרון 5% האצבעות PTU ב 22-24 שעות שלאחר ההפריה (hpf) כדי לדכא היווצרות של פיגמנט. זה משפר את הבהירות של הדמיה הינה חיונית לביצוע שני הפוטונים axotomies של אקסונים חושית. אם פיגמנט טבעי מותר צורה, autofluorescence מאפילה על אקסונים מיקרוסקופ שני הפוטונים. האצבעות פתרון דג הזברה מכיל 116 mM NaCl, KCl mM 2.9, 1.8 מ&quot;מ CaCl 2, HEPES 5mm, pH 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עוברים על ידי הוספת ~ tricaine 0.02% ל PTU האצבעות. הפוך את החיות בטוח לא מגיב למגע לפני שתמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו את החדר לטווח ארוך הדמיה על ידי יישום גריז ואקום בצד אחד של טבעת זכוכית או טפלון ולתקן אותו להחליק על כיסוי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה חד העובר לתוך הפתרון agarose 42 מעלות עם pipet זכוכית, נזהר שלא להעביר יותר את האצבעות PTU, ולאחר מכן להעביר את העובר עם טיפה אחת agarose להחליק על כיסוי מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העובר הרצוי כמו agarose מתקשה. זכור כי הקאמרית הדמיה יהיה התהפך כשתסיים כך להחליק לכסות יהיה המשטח העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש לך במה ממונע ובמקומות תמונה מרובות בבת אחת יכול, חזור על שלבים 1.4-1.6 עבור העובר כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר agarose כדי לחזק לחלוטין, ולאחר מכן למלא את הטבעת עם 0.02% tricaine PTU האצבעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח משחה ואקום לצד השני של הטבעת (ים), ואז לכסות את הטבעת (ים) עם זכוכית שקופית. תהפכו את חדר אטום (ים) מעל. לשכות אלה יכולים לשמש עבור הדמיה על מיקרוסקופים זקוף או הפוך. </li></ol> חלק 2: שני הפוטונים axotomy באמצעות אישית בנוי שני הפוטונים מיקרוסקופ עם TI-Sapphire Chameleon לייזר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכונו הדמיה. מניחים את העובר רכוב (ים) על מחזיק שקופיות מתחת למיקרוסקופ. פוקוס על העובר אחת עם מטרה (0.8 NA) 40X מים. הפעל את הלייזר. אנחנו כבר יכולים לדמיין reproducibly ונזק GFP להביע הנוירונים באמצעות הפרמטרים הבאים. כדי להמחיש אקסונים בהספק שאינו מזיק, הגדר לייזר באורך גל של 910 ננומטר (ננומטר) וכוח של 30 milliwatts (mW המפורטים הם את כמות החשמל בבית המדגם). פתח את תוכנת הדמיה. אנו משתמשים בתוכנה ScanImage שפותחה במעבדתו של קארל סוובודה 2, 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצו להתמקד כדי לסרוק את העובר עם לייזר שני הפוטונים, אתר את האקסון ברצונך axotomize, ו ללכוד תמונה של האקסון הזה. סמן את העמדות Z הראשונה והאחרונה, לרכוש את התמונה, ולעשות השלכה המרבי של ערימות Z. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדלה 70X על ענף של האקסון ברצונך axotomize ולהפסיק סריקה. הגדלת mW על המדגם לכוח המזיקות של 180 mW, ולבצע סריקה אחת עם הלייזר. אנו עושים זאת על ידי הגדרת מספר פרוסות ת&#39;עד 1 ולחיצה על &quot;גזל&quot;. זה אמור להיות מספיק כדי לנתק את האקסון. ראה דיון על שיטות לייעל את הליך זה עבור מיקרוסקופ שלך המטרה ניסיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זום החוצה, ולצמצם את כוח 30 mW ולקחת תמונה. </li></ol> חלק 3: שני הפוטונים axotomy על Zeiss 510 מיקרוסקופ confocal / שני הפוטונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום רכוב עובר לבמה ולהביא אותו אל המוקד באמצעות המטרה מים 25X או מטרה מתאים אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את שני הפוטונים (910 ננומטר) ארגון (488 ננומטר) לייזרים בסביבה מרובת המסלול, כך שאפשר לעבור מאחד לשני. למרות שגם לייזרים המשמשים לאיתור GFP, פליטת שני פוטונים הוא דמיינו עם אדום, ואת פליטת לייזר עם ארגון ירוק כדי להבדיל בין השניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש לייזר ארגון לזהות האקסון לפגוע. תחת הגדרות Z לסמן את הסעיפים אופטי הראשונה והאחרונה. קחו תמונה confocal וליצור הקרנת המקסימלי של מחסנית Z. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את האזור של האקסון להיפגע ולהביא את האזור למוקד. כבה את לייזר ארגון ולהדליק לייזר שני הפוטון. סרוק את הדגימה עם שני הפוטונים בעצימות לייזר של שידור ~ 9% על מנת לוודא כי האקסון הוא עדיין בפוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;עצור&quot;, כך כלי החיתוך יהיה זמין. השתמש לחתוך כדי להתמקד על שטח של עניין. בדרך כלל אנחנו הזום ~ 70X (זום ניתן לבדוק תחת הלשונית &quot;מצב&quot;). תחת הלשונית &quot;ערוצים&quot; לשנות את העוצמה של שני הפוטונים מן השידור ~ 9% לשידור% 15-20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתק את האקסון להפעיל את &quot;מהיר XY&quot; כפתור 1 על השני ואז ללחוץ על כפתור לעצור כדי למנוע נזק מיותר. האקסון יש לראות פסולת מפוזרות אם ההליך עבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח האקסוןנפגע לחזור 488 ננומטר ארגון לייזר, לקחת תמונה אחרת confocal, וליצור הקרנת מקסימלית. </li></ol> חלק 4: הדמיה Confocal זמן לשגות על Zeiss LSM 510 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכונו הדמיה. אם אתה משתמש במה מחומם, כדי להיות בטוח להפעיל אותו לפחות 30 דקות לפני הקמת הסרט זמן לשגות שלך. מניחים את העובר רכוב (ים) על מחזיק שקופיות מתחת למיקרוסקופ. פוקוס על העובר אחד עם המטרה האוויר הרצוי. אנו משתמשים 20X, 0.5 אובייקטיבי NA. פתח Zeiss LSM 510 תוכנת הדמיה. הפעל את הלייזר מתאים להגדיר את התצורה הרצויה. נעבור עתה לתאר פרוטוקול מפורט עבור הדמיה לטווח ארוך עם תוכנת LSM Zeiss זמן רב. שיטות אלה ניתן להתאים לשימוש מיקרוסקופ שלך עם תוכנת הדמיה שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המיקום ואת התצורה של העובר הראשון שלך בחלון זמן רב. פתח את הסריקה, במה, חלונות זמן רב. הפעל סריקה מהירה על חלון הסריקה. הזז את הבמה למצב XY הרצוי. סמן את העמדות Z הראשונה והאחרונה בחלון הסריקה. לחץ להפסיק, אמצע אז, גם בחלון הסריקה. חכו הסריקה של הפרוסה באמצע Z כדי לסיים, ולאחר מכן הקש עמדה בסימן בחלון הבמה. אם אתה רק הדמיה one העובר, לחץ על הכרטיסייה &quot;בית גיל&quot; בחלון זמן רב. לחץ על &quot;החלף XYZ&quot; ואז על &quot;שמור הגדרות&quot;. מסכים כאשר ביקש להחליף את התצורה הקודמת. המשיכו לשלב 4.4. אם יש לך במה ממוכן, באפשרותך להגדיר מיקומים מרובים עוברים מספר תמונות. במקרה זה, אתה צריך לבחור את &quot;מיקומים&quot; הכרטיסייה לפני הגדרת XYZ ותצורה עבור המיקום הראשון שלך. כמו כן, הקפד כי התפריט הנפתח מתחת הכרטיסייה &quot;מיקומים&quot; הוא על מיקום 1, וכי התפריט הנפתח בחלק תצורה אומר רב loc 1, לפני שאתה לוחץ על שמירת התצורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המיקום ואת התצורה של העוברים הנותרים שלך בחלון זמן רב. אתר העובר הבא שלך, ולאחר מכן לחץ על סריקה מהירה, להזיז את הבמה למצב XY הרצוי, סימן עמדות הראשונה והאחרונה שלך Z בחלון הסריקה. לחץ להפסיק, אמצע אז, גם בחלון הסריקה. חכו הסריקה של הפרוסה באמצע Z כדי לסיים, ולאחר מכן הקש עמדה בסימן בחלון הבמה. לחץ על &quot;החלף XYZ&quot;. בדוק את התפריט הנפתח ממש מתחת ללשונית &quot;מיקומים&quot; הוא על מיקום 2, וכי התפריט הנפתח בחלק תצורה אומר loc רב 2, ואז ללחוץ על &quot;שמור הגדרות&quot;. מסכים כאשר ביקש להחליף את התצורה הקודמת. חזור על תהליך זה עבור העוברים הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת פרמטרים לרכישת התמונה בחלון Loc רב. בחר את האפשרות GR-GL בסעיף &quot;רשימה של בלוקים&quot;, ולאחר מכן להזין את מספר החזרות הרצוי של הקבוצה. זהו מספר הפעמים confocal תרכוש תמונה במיקום זה. הזן את המרווח הרצוי לחכות בסעיף פרמטרים. זהו משך הזמן מתחילת החזרה one הדמיה כדי להתחיל את החזרה הבאה. בחר &quot;ZStackXY&quot; בסעיף תצורה. הזן את שם הקובץ בסיס בחלק התחתון. לחץ על &quot;DB בחר תמונה&quot; ובחר mdb שלך. לחץ על כפתור &quot;אפשרויות&quot;. בחר בתיקיית mdb שלך להציל את הקבצים הזמניים. בדוק &quot;לשמור על התמונה הסופית פתוח&quot;, &quot;להציל את התמונה הסופית&quot;, ו &quot;באמצע הערימה z&quot;. בחר להמתין מרווח. לחץ על אישור כדי לסגור את חלון אפשרויות. לחץ על &quot;הזמן להתחיל&quot;. השאירו חלון פתוח זמן רב למשך של הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח הנתונים. כאשר זמן לשגות הדמיה סיימה, את התוכנה זמן רב ירכז את כל הקבצים הזמניים שלך לתוך קובץ סיכום עבור כל מיקום. אם אתם רוצים לעצור את הסרט לפני שהוא מלא, הקפד ללחוץ על &quot;סיום&quot; במקום &quot;עצור&quot;, כך קובץ סיכום תיווצר. קבצים זמניים וקבצי סיכום צריך להיות נשמר אוטומטית לתיקיה mdb המיועד. מתפריט התוכנה LSM, לחץ על &quot;צפה 3D&quot;, ואז &quot;הטלה&quot;. עם קובץ סיכום שלך שנבחרה בתפריט הנפתח, לחץ על &quot;החל&quot;. זה יפיק תחזיות מרבי של מחסנית Z עבור כל תמונה confocal. בתפריט התוכנה LSM, לחצו על &quot;קובץ&quot;, ולאחר מכן &quot;ייצוא&quot;. שמור את תחזיות המרבי כסדרה של קבצי tif. לאחר מכן תוכל ליצור סרט מתוך סדרה של קבצי tif באמצעות ImageJ או QuickTime Pro. אקסונים בתמונות LSM ניתן לייחס בשלושה ממדים באמצעות ניתוח התמונה בתוכנה (למשל NeuroLucida מ MicroBrightfield) כדי להפיק מידע כמותי מפורט על מורפולוגיה האקסון. </li></ol> חלק 5: תוצאות נציג ניסוי מוצלח יביא ייצוג מדויק של הדינמיקה הסלולרים של החלמה מפציעה האקסון. עוברים שלך יהיה בריא לאחר הדמיה, עם ניוון לא גלוי דופק חזק. Axotomy אמור לגרום נזק מדויק, רק ניתוק ענף מוגדר של האקסון. לא צריך להיות שום פגיעה אקסונים שמסביב מוות של תאים מינימלי. אנו מאמינים כי אנו רואים את מותו של תא אפידרמיס בודד ישירות על האתר axotomy של 50% ~ של ניסויים. אם אתה מבחין יותר נזק, אתה צריך לייעל את פרוטוקול שני הפוטונים שלך כמתואר בדיון.

<ol>
	<li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors.">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScanImage:+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li><li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience.">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li><li>Sacconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons.">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li><li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurosurgery:+functional+regeneration+after+laser+axotomy.">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li><li>Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+laser+cellular+microsurgery.">Mechanisms of laser cellular microsurgery.</a> Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).</li></ol>

השתמשנו בשיטות המתוארות במדויק axotomize אקסונים חושית הפריפריה ישירות לקיים התחדשות בעובר חי דג הזברה. ארוך טווח זמן לשגות הדמיה confocal של דג הזברה יכול לשמש כדי לצפות תהליכים התפתחותיים רבים in vivo. הליך שני הפוטונים axotomy המתואר יכול להיות שונה עבור מטרות רבות ניסויים...

two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

דג הזברה כבר מזמן מנוצל כדי ללמוד את המנגנונים תאית ומולקולרית של פיתוח על ידי הדמיה זמן לשגות של העובר שקוף החיים. כאן אנו מתארים שיטה לעלות עוברי דג הזברה הדמיה לטווח ארוך להדגים כיצד להפוך את לכידתו של זמן לשגות תמונות באמצעות מיקרוסקופ confocal. כמו כן, אנו מתארים שיטה כדי ליצור נזק מבוקר, מדויקת ענפים בודדים של אקסונים חושית הפריפריה דג הזברה באמצעות כוח ממוקד של לייזר femtosecond רכוב על מיקרוסקופ שני הפוטונים. הפרמטרים עבור axotomy שני הפוטונים מוצלח חייב להיות מותאם לכל מיקרוסקופ. נדגים שני הפוטונים axotomy משני מיקרוסקופ אישית שני הפוטונים בנוי 510 Zeiss / confocal שני הפוטונים לתת שתי דוגמאות. נוירונים דג הזברה חושית trigeminal ניתן דמיינו ב-GFP קו מהונדס המבטא מונע על ידי האמרגן תא עצב תחושתי ספציפי 1. אנחנו צריכים להתאים את המודל הזה trigeminal דג הזברה ישירות לקיים התחדשות האקסון חושית חיים עוברי דג הזברה. עוברים מורדמים עם tricaine וממוקמים בתוך טיפת agarose כפי שהיא מחזקת. עוברים משותקת סגורים בתוך תא הדמיה מלאים phenylthiourea (PTU) האצבעות. מצאנו כי עוברי ניתן הדמיה ברציפות במשך 12-48 שעות בתאי אלה. תמונה confocal אחד הוא נתפס לאחר מכן כדי לקבוע את האתר הרצוי axotomy. האזור של עניין נמצא על מיקרוסקופ שני הפוטונים על ידי הדמיה אקסונים חושית תחת צריכת חשמל נמוכה שאינם מזיקים,. לאחר התקרבות באתר הרצוי axotomy, הכוח הוא גדל סריקה אחת של אזור מוגדר מספיק כדי לנתק את האקסון. הדמיה מרובים זמן לשגות במיקום מוגדר אז על מיקרוסקופ confocal ישירות לקיים axonal התאוששות מפציעה.

Watch this Scientific Journal Video about Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos at JoVE.com

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

כאן אנו מתארים שיטה הרכבה עוברי דג הזברה הדמיה לטווח ארוך, שני הפוטונים הדמיה רקמות נזק טכניקות זמן לשגות הדמיה confocal.

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

two-photon-axotomy-time-lapse-confocal-imaging-live-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Views.  University of California, Los Angeles. כאן אנו מתארים שיטה הרכבה עוברי דג הזברה הדמיה לטווח ארוך, שני הפוטונים הדמיה רקמות נזק טכניקות זמן לשגות הדמיה confocal.

Video: Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

השתמש של מיקרוסקופיה מעבר זמן לדמיין אנימצית מושעה anoxia מושרה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; עוברים

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...