給与や研究支援は、米国大豆ボードによって提供され、州と連邦資金でオハイオ州立大学/オハイオ農業研究開発センターに充当された。この研究はまた、部分的にCONACYT、メキシコ、からCMHGへのフェローシップによってサポートされていました。商標または所有者の製品に関する記述は、OSU / OARDCにより、製品の保証または保証するものではありませんし、またも適当かもしれない他の製品の除外に承認を意味するものではありません。ジャーナル813827 HCS 9月17日。

以下の方法論は、自動画像収集システムを使用して遺伝子発現の画像解析のためのプロトコルの概要を説明します。説明を簡単にするために、全体的なアプローチは、4つのステップに分けるれました：1）種子の準備、2）遺伝子導入をパーティクルガン法、3）ロボットのイメージのコレクション、および4）画像解析を用いた。この一般的な方法論が他のアプリケーションの広い範囲で使用できますが、プロトコルの現在のセットは、同じ部分で遺伝子発現を追跡するための有用なレポーター遺伝子である緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子、の使用に基づいています。時間をかけて生きている組織。 I.種子の準備<ol><li>リマ豆（。 インゲンlunatus CVヘンダーソン-ブッシュ）の種子を購入、または理想的に成長チャンバー内で生育した植物（相対湿度50％、16 / 8時間ライト：暗い、23分の25 ° C昼/夜）から収穫することができます。収穫後の種子の品質は、-20℃で保存する種子を維持することができる</li><li>種子の発芽のためにマゼンタGA7容器を準備します。マゼンタボックスの底部に収まるようにろ紙またはペーパータオルを折りたたみます。ペーパータオルを湿らせて、各コンテナに〜25 mLの脱イオン水を追加し、オフ吸収されない水を注ぐ。オートクレーブは、20分の用紙を含むボックスを湿らせた。 </li><li> 60rpmで旋回シェーカーで振とうしながら20分間（20〜40ミリリットルで20種）10％市販の漂白液に種子を殺菌、50 mlのディスポーザブル遠沈管を使用する。 注：以降の手順はすべて、層流フードで実行する必要があります。 </li><li>各洗浄中に30秒間穏やかに撹拌しながら滅菌脱イオン水で種子を4-7回すすいでください。 </li><li>各滅菌マゼンタボックス内にある折り畳まれた紙の層の間に5〜6滅菌種子を置きます。 </li><li> 25 ° C、16 / 8時間ライト：：ダーク、40μEm-2 s -1と 、以下の条件で4日間のシーズをインキュベートする。 </li></ol> II。粒子衝突を利用した遺伝子導入<ol><li>生体組織で監視することができるレポーター遺伝子と、お気に入りの発現ベクターを用いた遺伝子構築物を構築する。我々は、プロモーターとプロモーター要素解析のための高コピー数の発現ベクターが有用設計した。このベクターは、プロモーター/変換された組織におけるプロモーター要素の機能を視覚化するために使用されるGFP遺伝子が含まれています。 </li><li>発芽苗から砲撃、消費税リママメの子葉の前にhを1月2日前後と種皮を取り除く。砲撃に適した子葉は、緑の平らな、さらに画像解析の妨げとなる被害の自由な光を黄色にする必要があります。 </li><li>すぐに摘出した後、MS塩1、B5ビタミン2、3％スクロースおよび0.2％ゲルライトを液（pH 5.7）を含むOMSの培地上での場所は子葉。 </li><li> DNAは、M10タングステン粒子（シルバニア、トワンダ、ペンシルバニア州、米国）の上に構築沈殿する。 0.6ミリリットルのマイクロ遠心チューブに、25μlのタングステン粒子（粒 ​​子が右使用前に、滅菌水、100mgのml -1の中に再懸濁している）、5μlのDNA（1μgの液-1）、25μlの2.5 Mの塩化カルシウム（シグマを追加アルドリッチの猫。C3881 - 500G）と10μlの100mMのスペルミジン（SigmaカタログS - 2626）。徹底的にすべてのコンポーネントを混在させる簡単に渦。 </li><li> 5分間氷上でDNA調製をインキュベートする。その後、50μlの上清を除去して捨てる。 </li><li>ボルテックスでDNA被覆粒子を再懸濁し、すぐに2μlのアリコートを削除します。このボルテックスステップのアリコートをチューブから削除されるたびに繰り返します。被覆粒子が氷に保持され、15分以内に使用する必要があります。 </li><li>シリンジフィルターの上部を通じ、場所、フィルタ画面の中央に2μlのコーティングされた粒子。パーティクルガンチャンバー内のフィルタ保持部に被覆された粒子を含むフィルタユニットを置きます。 </li><li>バッフルにリママメ子葉葉の表側を上にし、パーティクルガンチャンバー内にバッフルを置きます。ビーカーの底に溶け画面で構成されてバッフルは、、爆撃の間に組織をサポートするためのプラットフォームとして使用されます。 </li><li>攻め、次のようにパーティクルガン（この方法論では、我々は単純で安価な粒子の流入ガン3を使用する 、私たちの研究室で設計された豚を、）を使用して組織;）B、チャンバーを排気するように真空につながるバルブを開いて）後に真空は、粒子衝突の後、真空ラインのバルブを閉じ、排気バルブを使用して真空を解除760ミリメートル（30）水銀、ソレノイドをアクティブにし、粒子を推進するためにヘリウムを放出、C）に達する。粒子を加速するために使用するヘリウムの圧力が50 PSIです。 </li><li>真空が解放された後、砲撃子葉を取得し、OMSの培地に、子葉、葉の表側を返すようにチャンバーの扉を開きます。 注：定量化と発現プロファイリングのため、我々は通常、すべてのDNA構築物の3つの子葉の最小値を攻め。通常はDNAであるポジティブコントロール、よく研究された遺伝子発現プロファイルを得、その構造、参照用として用意されています。 </li></ol> III。自動化された画像コレクション<ol><li>水銀ランプの電源を入れ、ウォームアップするためにランプのために30分間待ちます。 </li><li>スポット- RT CCDカメラ（診断インスツル株式会社、スターリングハイツ、ミシガン州、米国）とロボットプラットフォームの運動を駆動するロボットプラットフォームモータコントローラ、のために電源をオンにします。 </li><li> MZFLIII解剖顕微鏡（ライカ、Heerbrugg、スイス）で、（例40分の480 nmの、エム510 LP。。GFP2フィルターセット）GFP検出用フィルターセットを設定します。 </li><li> 70％エタノールを噴霧して厚くポリカーボネートペトリ皿の蓋を滅菌する。ペトリ皿のベースをカバーするために使用される特殊なふたは、画像のコレクション4の間に結露を防ぐ。 </li><li>自動画像収集システムのロボティクスのプラットフォーム（Arrickロボット、ハースト、テキサス州、米国）に砲撃子葉を含むプレートを置きます。ロボティクスプラットフォームは、ステッピングモータのセットで駆動し、8のペトリ皿の添付ファイルのためにテーブルで構成されています。プラットフォームは、ポリカーボネート、ポリプロピレンとアルミで構成されている。プレートは、横方向のプラスチック製の固定ネジを締めて、位置に固定されている。 </li><li>ロボティクスのプラットフォームと画像取得の両方を制御するカスタムソフトウェアアプリケーションを開きます。また、ソフトウェア白色光のコントローラのスイッチを開きます。 </li><li> &quot;モーターの動き&quot;タブで、&quot;モーターオン&quot;と&quot;モーターホーム&quot;をクリックしてください。ソフトウェアは、ホームポジションへのプラットフォームの向きがした後、我々はすべての子葉のための位置の入力を開始する準備が整いました。 </li><li> &quot;モーターの動き&quot;タブでは、最初のプレートを選択します。プラットフォームは、顕微鏡の対物下でペトリ皿の中央に配置します。移動距離のボタンを使用して、正確に画像のコレクションの最初の子葉を置きます。上に白色光コントローラと、ターゲット領域は、&quot;ライブモード&quot;機能をオンにすることでコンピュータのモニターを通して観察することができます。 </li><li>第一子葉の場合は、解剖顕微鏡で手動ノブを使用してフォーカスし、倍率（1.6倍倍率が優先される）を設定します。同じプレート上の残りの子葉のための焦点調整がロボットのプラットフォーム上で、それぞれのプレートの下にある3つのレベリングのネジを使用して作られています。 </li><li>関心領域が設定されると、&quot;この位置に追加&quot;ボタンをクリックしてください。ソフトウェアは、位置のスケジュールファイルにこの領域の座標を追加し、プラ​​ットフォームは、プレートの中央に戻ります。 </li><li>位置を設定し、移動距離のボタンとマニュアルレベリングのネジを使用して、プレート上に残っているすべての子葉のために焦点を当てる。すべての子葉のすべての座標を入力したら、位置のスケジュールの座標を保存します。 </li><li>画像コレクションのパラメータを入力します。 &quot;画像設定&quot;タブでは、光、希望の種類を選択し、白または青。 GFPの検出のために、唯一の青い光を使用する必要があります。また、露出設定を入力します。我々は赤、青と緑の色のために独立して露出の時間を変更できますが、我々は通常、私たちが直接確認できるようにGFPの写真 - ドキュメント（それぞれ赤の場合は20、14と14秒、緑と青のチャンネル、）のために同じ設定を使用して、異なるDNA構築物間で一貫性の比較。 </li><li>同じ&quot;画像設定&quot;タブでは、イメージを保存する空のフォルダを指定します。画像の各シリーズは、子葉に入力された位置の順序に従って順次番号、独立したフォルダ内のこのマスターのフォルダ内に保存されます。 </li><li> &quot;キャプチャ時間のコントロール&quot;タブに移動し、画像取得の時間間隔と画像のコレクションのサイクル数の合計を設定します。画像は、一般的に、明確に定義された遺伝子発現プロファイルを生成し、100時間のために時間ごとに収集されます。 </li><li>をクリックして画像取り込みを開始&quot;実行スケジュール！&quot; &quot;位置のスケジュール&quot;タブにあるボタン。 </li><li> 100時間の映像コレクションの最後に、さらに画像解析のためのあらゆる大容量のハードドライブまたはコンピュータにロボットを制御するコンピュータからのすべての画像を転送。高解像度の画像は（1600 × 1200ピクセル）〜5 MBそれぞれを測定するTIFファイルとして収集されます。 </li></ol> IV。画像解析<ol><li> Adobe ImageReadyを使用して、各フォルダから100連続した画像を組み立てる。 <ol><li> ImageReadyを開き、フレームなどのシリーズを構成するすべての連続した​​画像をインポートします。 </li><li> 800 × 600ピクセルのオリジナル画像のサイズを変更します。収集された画像は、画像処理が遅くなることが大きなファイルを生成する高解像度、です。 </li><li>画像をスクロールして、ほとんどの画像に表示されるスポット（s）を見つける。 </li><li>選択されたスポット（複数可）に300％までズームできます。高倍率を用いて画像の位置合わせは、より正確に登録することができます。 </li><li>すべての画像の上に層を挿入し、すべてのフレームに表示されていることを確認してください。 &quot;ペイントブラシ&quot;ツールを使用してスポット（複数可）の位置をマークします。 </li><li> &quot;移動&quot;ツールを使用してすべてのフレームを合わせ、基準としてレイヤーにマークを取り始める。 </li><li>アライメントが完了すると、参照として使用されるレイヤーを削除し、単一の&quot;PSD&quot;ファイルとして画像を保存。また、最高の解像度を使用して単一の&quot;mov&quot;ファイルとしてすべてのフレームをエクスポートします。各画像のシリーズのマニュアルアライメントは〜10分かかります。 </li></ol></li><li> ImageJを用いて遺伝子発現の定量化を行います。 <ol><li>オープンImageJはソフトウェアとImageReadyで以前に保存されたの&quot;mov&quot;ファイルを開きます。 </li><li>選択ツールを使用して、400 × 300ピクセルの面積と作物のイメージを選択してください。この新しいファイルは&quot;AVI&quot;ファイルとして保存する必要があります。 </li><li> &quot;画像&quot;、&quot;色&quot;と、ImageJの&quot;RGBの分割&quot;をクリックして、赤、青、緑のチャンネルに新しい&quot;AVI&quot;ファイルにある連続した画像を、で区切ります。 </li><li>緑と赤のチャネル内のすべての画像からのバックグラウンド蛍光を引きます。グリーンチャンネルの画像のシリーズを使用して、非発現細胞と地域から、20 × 20ピクセルの領域を選択し、同じ領域が両方のチャネルで選択されるように、&quot;ROIマネージャ&quot;ツールでその場所を記録。緑のチャネルでアクティブな20 × 20ピクセルの正方形で、ImageJのタスクバーにある&quot;プラグイン&quot;コマンドに移動して、プラグイン、ツール&quot;スライスごとに減算測定ROI&quot;をクリックしてください。 </li><li> ImageJのでは、その後、GFPを発現しているピクセルを定義したり、セグメントに&quot;閾値&quot;を&quot;調整&quot;、&quot;イメージ&quot;をクリックして。 20から30ピクセルの平均スポットサイズを取得するためのしきい値ウィンドウでバーをドラッグしてしきい値レベルを調整します。 </li><li>我々は平均値は、ピクセルあたりの値との合計数GFPを発現しているピクセルをグレースケールに測定するために設計されたというプラグインを使用してGFPの発現を決定する。 </li><li>平均出力をコピーするには、Microsoft Office ExcelにImageJと貼り付けで値をグレースケール。平均値を乗じて各チャンネルのGFPの発現（赤と緑）を計算すると、各チャンネルのGFP発現のピクセルの合計数でピクセルあたりの値をグレースケール。両方のチャネルの式の値の合計は、GFPの発現が得られます。値は、遺伝子発現プロファイルを例示し、直接比較を行うために使用することができます。時間経過のアニメーションは、遺伝子発現プロファイルのユニークで明確な可視化を提供する、&quot;MOV&quot;または&quot;AVI&quot;ファイルを使用して生成することができます。 </li></ol></li></ol> V.代表の結果ロボットの画像の収集と分析の手順（図1）ここで報告短い期間での遺伝子発現に関する定量的な大量のデータの取得が可能です。 GFP遺伝子を用いた植物プロモーターの特徴付けのために、この方法論は、唯一の一過性発現プロファイルを作成する（図2）だけでなく、一過性および安定に形質転換植物の組織5,6の詳細-方法のGFPの発現で追跡するために有用ではない。収集された連続画像で生成された短い時間経過のアニメーションは、植物組織の経時遺伝子発現の詳細な分析のための貴重なツールです。この方法論は、直接遺伝子発現に影響を​​与える要因を評価するための優れたアプリケーションを持っています。例えば、ウイルスの起源のサイレンシングの異なるサプレッサーの存在下で一時的なGFPの発現が正常に私たちの自動画像収集と分析のシステム7,8を用いて研究されてきた。 <img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig1.jpg" alt="図1" /> 図1画像解析の手順は、次の4つの主要ステップで構成されています。ロボットの画像収集システムを使用して、イメージのシリーズの（A）の取得、画像の（B）分離、赤、青、緑のチャンネルに、しきい値レベルを調整することによって表現するピクセルの（C）セグメンテーション、及び（D）の出力結果を得を含む値とGFP発現フォーカスカウントをグレースケール。 <img src="/files/ftp_upload/1733/1733fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。GFPに融合した植物プロモーターによって駆動される別の一時的な発現プロファイルを示すグラフ。データは、当社のロボットの画像収集システムを用いて採取とImageReadyとImageJのソフトで分析した。

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	<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+medium+for+rapid+growth+and+bioassays+with+tobacco+tissue+cultures.">A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures.</a> Physiol Plant. 15, 473-497 (1962).</li><li>Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient+requirements+of+suspension+cultures+of+soybean+root+cells.">Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.</a> Exp Cell Res. 50, 150-158 (1968).</li><li>Finer, J. J., Vain, P., Jones, M. W., McMullen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+particle+inflow+gun+for+DNA+delivery+to+plant+cells.">Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells.</a> Plant Cell Rep. 11, 232-238 (1992).</li><li>Finer, J. E., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+reducing+moisture+condensation+on+Petri+dish+lids.">A simple method for reducing moisture condensation on Petri dish lids.</a> Plant Cell Tiss Org. 91, 299-304 (2007).</li><li>Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+35S+and+Lectin+promoters+in+transgenic+soybean+tissue+using+an+automated+image+acquisition+system+and+image+analysis.">Comparative analysis of 35S and Lectin promoters in transgenic soybean tissue using an automated image acquisition system and image analysis.</a> Plant Cell Rep. 25, 290-296 (2006).</li><li>Chiera, J. M., Bouchard, R. A., Dorsey, S. L., Park, E. H., Buenrostro-Nava, M. T., Ling, P. P., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+two+highly+active+soybean+(Glycine+max+(L.)+Merr.)+promoters+and+their+characterization+using+a+new+automated+image+collection+and+analysis+system.">Isolation of two highly active soybean (Glycine max (L.) Merr.) promoters and their characterization using a new automated image collection and analysis system.</a> Plant Cell Rep. 26, 1501-1509 (2007).</li><li>Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+extension+of+transient+GFP+expression+by+the+co-introduction+of+a+suppressor+of+silencing.">Quantification and extension of transient GFP expression by the co-introduction of a suppressor of silencing.</a> Transgenic Res. 17, 1143-1154 (2008).</li><li>Dhillon, T., Chiera, J. M., Lindbo, J. A., Finer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+six+different+viral+suppressors+of+silencing+using+image+analysis+of+transient+GFP+expression.">Quantitative evaluation of six different viral suppressors of silencing using image analysis of transient GFP expression.</a> Plant Cell Rep. 28, 639-647 (2009).</li></ol>

ロボットの使用は、人間の生活のさまざまな側面で巨大なアプリケーションがあり、特に、ロボットが効率的に退屈で複雑なアクティビティを自動化するために、そしてより正確な方法でタスクを遂行するために、危険な環境でのアクティビティを実行するために使用されている。分子生物学、特に遺伝子発現解析では、ロボットは遺伝子だけでなく、機能だけでなく、時間をかけて組織の成長と発展を追跡するのに役立ちます。多くの生命現象は、単一の時点の観測値を使用して従うことが困難になる可能性がある、動的に発生。 発現研究のためのGFP遺伝子の使用は、組織の反応と成長を観察するための付加的な利点をもたらします。我々の実験手順については、GFPはGFPの検出は非破壊的であるとして、私たちは時間の経過とともに組織の同じ部分で遺伝子発現をたどることができます。さらに、GFPタンパク質の私たちのバージョンでは、検出を可能にするために十分に安定であるだけでなく、私たちは遺伝子発現の立ち上がりと立ち下がりの両方を追うことのできる、植物組織での蓄積を最小限に抑えるために、いくつかの売上高を示しています。 我々は、すでに幅広い用途で私たちのロボットの画像の収集と分析のシステムを利用してきた。我々は、現象の動的な理解が望まれる多くの生物学的用途のための高いポテンシャルを予測する。例えば、植物組織の成長と発展は、貴重な洞察/これらのプロセスに関する情報を提供する私たちのシステムを使用して追跡することができます。また、GFPなどのレポーター遺伝子を用いたタンパク質輸送のダイナミクスは、タイムラプスアニメーションを使用して容易に視覚化することができます。このレポートで説明される方法は技術的に複雑ですが、概念的には簡単です。我々の結果は強固であり、新しいアプリケーションが絶えず発見されている。

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ImageJ</td>
<td>Software</td>
<td>U. S. National Institutes of Health</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a></td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

robotics and dynamic image analysis for studies of gene expression in plant tissues

植物組織における遺伝子発現は、通常のための植物組織からの化合物の破壊的な抽出によって研究されている<em&gt; in vitroで</em&gt;分析。メソッドは、緑色蛍光タンパク質を利用するここで紹介（<em&gt; GFP</em時間をかけて組織の同じ部分の遺伝子発現の継続的なモニタリングのための&gt;）遺伝子、。市販<em&gt; GFP</em&gt;遺伝子は異なるプロモーターの調節制御下に置かれ、粒子衝突を介してリママメ子葉組織に導入されました。子葉は、デジタルカメラと培養皿のセキュリティで保護された添付ファイルを許可するようにカスタム設計された2次元のロボットプラットフォームと蛍光解剖顕微鏡で構成されたロボットの画像収集システム、上に置いた。画像は、各プロモーターの発現プロファイルを生成するために100時間のための子葉組織毎時間から採取された。 100枚の画像の収集された各シリーズは、最初に巣をGFPが発現確実にするためImageReadyを使用して手動で画像の位置合わせを行った一貫して分析の選択されたフィールド内に保持された。 300 × 400ピクセルを測定する一連の特定の領域が、その後、ImageJのソフトウェアを使用してGFPの強度の測定を提供するために、さらなる分析のために選択した。バッチの画像、赤、緑、青チャンネルとGFP発現のエリアに分かれていたがImageJのしきい値の機能を用いて同定した。それぞれ赤と緑のチャンネルでバックグラウンド蛍光を（すべてのピクセルから非発現ピクセルのグレー値の減算）減算した後、GFP強度は平均値を乗じて算出した各GFP発現のピクセルの合計数でピクセルあたりの値をグレースケールチャネル、続いて赤と緑のチャンネルの両方にこれらの値を追加します。 GFPの強度値は、発現プロファイルを得るためにすべての100のタイムポイントで収集された。 GFPの発現プロファイルの変動は、そのようなプロモーターの強さ、サイレンシングサプレッサーの存在、またはプロモーターの性質などの要因の違いに起因する。 GFP強度の定量化に加えて、画像のシリーズはまた、ImageReadyを使ってコマ撮りアニメーションを生成するために使用されていました。タイムラプスアニメーションは、緩やかな減少が続いて、細胞の大多数はGFP発現の比較的急速な増加を表示することを明らかにした。いくつかの細胞は時折急速な細胞死に関連するかもしれない蛍光の突然の損失を、表示。隣接するセルへの膜と細胞壁全体でGFPの見かけの輸送も観察された。時間の経過は、GFPの強度プロファイルまたは単一の時間ポイントのイメージのコレクションを使用してそうでなければ得られなかった追加の情報を提供するアニメーション。

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Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

我々は、導入、トラッキングおよび植物細胞におけるGFP発現の定量分析法を報告する。このメソッドは、時間の経過とともに、大量のサンプルから半連続画像コレクションのためにカスタム設計されたロボットのシステムを利用しています。我々はまた、画像系列の分析のためのImageJのとImageReadyの使用方法を示しています。

ロボット工学と植物組織における遺伝子発現の研究​​のための動的画像解析

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.4K ビュー.  The Ohio State University. 我々は、導入、トラッキングおよび植物細胞におけるGFP発現の定量分析法を報告する。このメソッドは、時間の経過とともに、大量のサンプルから半連続画像コレクションのためにカスタム設計されたロボットのシステムを利用しています。我々はまた、画像系列の分析のためのImageJのとImageReadyの使用方法を示しています。

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The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

エレクトロポレーションのためのマウス骨髄からの一次造血細胞培養の準備

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

生物学

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

ウイルス誘導ジーンサイレンシング（VIGS）でタバコbenthamianaとトマト

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

脊髄電気生理学

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

高効率で初代培養細胞をトランスフェクトするためにジーンパルサーMXcellのエレクトロポレーションシステムの使用

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

ナマルバ細胞におけるIL - 4依存性遺伝子発現のsiRNAのノックダウン：遺伝子発現研究を簡素化する自動化セルカウンターの使い方

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

からのタグ付き核の親和性に基づく分離<em&gt;ショウジョウバエ</em遺伝子発現解析のための&gt;組織

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

低酸素症後単一細胞レベルでのグローバルのRNA合成の分析

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

ダイナミックカルシウムの自動分析<sup&gt; 2 +</supイメージシーケンス内の&gt;の信号

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

ロボット工学と植物組織における遺伝子発現の研究​​のための動的画像解析

ロボット工学と植物組織における遺伝子発現の研究のための動的画像解析