このプロトコルは、少量の生物学的材料を使用して、関心のある植物の特定の細胞から空間および時間的転写を得るためにRNA-シーケンシングと組み合わせたレーザーキャプチャマイクロ解剖を使用する。レーザー技術の主な利点は、正常な組織コンテキスト内の細胞の直接可視化を容易にし、離散細胞を接触自由な方法で正確に単離できるようにすることである。このプロトコルは植物細胞の単離のために最適化されていますが、細胞学的に識別できるほとんどの細胞に適用することができます。
良いサンプル準備は非常に重要です。従って、この技術を初めて行う1つは、組織固定および埋め込みのプロップ最適化がレーザー捕捉マイクロ解剖の前に重要である。組織サンプルを採取する前に、採取する種および組織タイプに適した固定剤を調製する。
大麦シードの場合は、サンプルを少なくとも10倍の氷冷固定液に浸す前に、シードサンプルを半分に切ります。真空浸潤を使用して固定剤の浸透を促進します。組織は浸潤の終わりまでに沈み、その後、一晩のインキュベーションのために固定剤をリフレッシュし、組織処理のためにカセットにサンプルを移す必要があります。
組織にロードされたカセットを自動処理装置の金属バスケットに入れ、金属バスケットをチャンバー1の上のホルダーに取り付けます。ティッシュ・プロセッサーのコントロール・パネルにプログラムを設定し、start を押して自動処理プログラムを開始します。システムは示されるように、カセットを勾配の一連のエタノールに浸すことによってサンプルを脱水する。
最後のエタノール浸漬後、システムは示された溶液あたり90分間、キシレン勾配でサンプルを水没させます。その後、溶融パラフィンに290分浸漬し、摂氏55~60度で浸漬した。翌朝、組織処理装置からパラフィン浸潤カセットを取り出し、パラフィン埋め込み処理に進む。
翌朝、微細な鉗子を使用してプロセスサンプルを適切なサイズの金型に移し、各サンプルに溶融パラフィンを加えます。大麦の種子の場合、縦方向にパラフィンのサンプルを切断方向に向けて、縦方向のセクションの獲得を容易にします。カセットをカセットに固定するために、カセット全体を十分にカバーして十分な量のパラフィンを使用してください。
その後、ブロックを金型から解放する前に、パラフィンがセットされるまで10〜20分間コールドプレートに金型を置きます。PENメンブレンスライドを準備するには、RNS不活性化溶液のスライドを3秒間沈め、続いて2回の短い水解とDEPC処理水を水に沈めます。その後、残りの溶液を取り除くために370°Cインキュベーターでスライドを駆動し、UVはヘーゼルナッツではなくパラフィンを強化するために30分間層流キャビネットでスライドを扱います。
サンプル組織の切片は、冷たいプレート上にパラフィンブロックを配置し、DEPC処理水で水浴を満たし、その後、摂氏42度に暖めます。目的の領域の深さにブロックをトリミングし、6〜10ミクロンの厚さにパラフィンブロックを切り離します。よく切り離されたブロックは、ブレードの端にリボンを形成します。
細かいトゥイーンザーを使用して、リボンが水面に平らに置かれて、マイクロトームから水浴にそっとリボンを移します。セクションを収集するには、45度の角度でスライドを保持し、上向きの動きを使用してスライドにリボンを水から持ち上げ、糸くずのない組織を使用して余分な水を慎重に取り除きます。すべての切片を採取したら、キシレンで320秒の洗浄を行い、その後100%エタノールで230秒間洗浄し、70%エタノールで230秒間洗浄します。
デパラフィン化および乾燥した組織切片から目的の細胞をマイクロディセクストするには、3つのLCM顕微鏡スロットにスライドをロードし、収集チューブを利用可能なスロットに積み込みます。ステージを移動して、切り取る必要があるサンプルの領域を特定し、膜スライド上の組織のない空白のセグメントを切断します。切断速度とレーザー圧力の切断を最適化し、エネルギーとフォーカスをカタパルトする。
描画ツールを使用して、組織の対象領域を概説し、最適化されたパラメータとRobo LPC機能を使用して、細胞を接着剤キャップにカタパルトします。要素リストからフラグを選択して、フラグツールを使用して対象地域をマークします。キャップチェックボタンをチェックして、接着剤キャップを点検し、サンプルが取り込まれたことを確認します。
RNA抽出には、通常、キャップあたり10〜15個のセクションが必要です。すべてのサンプルが取得された直後に、RNAの分解を避けるためにすぐにRNA抽出に進みます。RNA抽出とRNA増幅後、メーカーの指示に従って、アンチセンスRNAを定量化し、修飾する自動化された電気泳動システムを使用します。
本研究では、LCM、RNAシーケンシングを、発芽中の48時間の時間経過で8時間ごとに、3つの胚器官から少数の細胞に適用した。切断パラメータを正しく調整して、対象の組織を正確に切断し、選択した領域の端を焼くことなく周囲の組織から外れるようにすることが重要です。RNA増幅前のRNA全体の影響により、良質のRNAサンプルで18および28Sリボソームサブユニットの明確な電気泳動バンドと蛍光ピークを検出することができます。
アンチセンスRNAの合成に成功すると、2回の増幅後に約300ヌクレオチドのピークを迎える100~1000ヌクレオチドの単様式対称サイズ分布を示します。発芽の48時間にわたって異なる組織で発現する遺伝子の多次元尺度プロットは、同じ時点からのサンプル間よりも単一の組織のサンプル間の類似性が大きいが、異なる組織を示す。差異発現遺伝子の数は、組織のゼロ時間の時点に対して各組織の発芽の過程で徐々に増加する。
この代表的な分析では、プルプルの25%、ラディクルの34%および41%の微分発現遺伝子が各組織内で排他的に発現していることが判明した。選択した領域のエッジを燃焼させることなく、周囲の組織からセレクター領域の正確な切除および削除のための切断パラメータを正しく調整することが重要です。改善されたクロマチンおよびタンパク質精製方法によって、質量分析計器を高める、LCMは、細胞型のエピゲノムおよびプロテオミクス研究のインプラントに使用することができる。
