我々は有用な議論とサポートのためにブライアンG.クーンとクラウディアB.ハンナに感謝。このプロジェクトは出発から立ち上げ資金によってサポートされていました。生物科学、R.クラウディオアギラとパーデュー大学がんセンター経由R.クラウディオアギラに米国癌学会機関の研究助成にパデュー大学。

A.細胞培養やタンパク質誘導このセクションでは、酵母細胞内の調節可能なプロモーターからタンパク質の発現誘導に続いて細胞の培養条件、ノコダゾールによる細胞周期の同期を、説明します。 <ol><li>野生型の酵母株W303（LEU2 - 3、112 TRP1 - 1 CAN1 - 100 URA3 - 1 ADE2 - 1 HIS3 - 11、15）の制御下に興味のある私たちの遺伝子を含む高コピー（2μ）プラスミドDNA（ENTH2）で形質転換されメチオニン抑制性プロモーター（MET25）の。メチオニン欠く培地では最大発現を可能にしながらメチオニン2mMのは、プロモーター活性を抑制するのに十分です。したがって、メチオニン濃度の範囲は、所望のレベルでタンパク質を発現するために使用することができます。 W303細胞におけるプラスミドDNAの1トランスフォーメーションは、標準の手順に従ってLiAc - TE法を用いて行われる2。 注：この実験は唯一のバックグラウンドレベルでのタンパク質発現を確保するためにメチオニン2mmの存在下で一晩細胞を増殖させることによって実行する必要があります。翌朝、蛋白質の発現は、メチオニン直後に細胞周期の同期（約4時間）を欠く培地で細胞を再懸濁することにより誘発されるべきである。しかし、我々は、すべての症状の分析のために時間のコースを作り、ENTH2依存性の細胞分裂の表現型が（通常、タンパク質の誘導3の4 - 6H後）ENTH2のかなりの濃度が細胞内に構築された後にのみ誘導されることを見出した（少なくとも16時間）が非常に長い表現。我々は、メチオニン0.2の存在下で一晩細胞を増殖する形態学的表現型を抑制するがメチオニン不足してメディアに転送するときに急速に表現型を誘発するレベルに高めることができる亜臨界タンパク濃度を可能にすることを見出した。これは時間の比較的短い期間での細胞分裂の欠陥の深刻な症状の詳細な分析を可能にします。我々は、それ故に、実験者は、ケースバイケースでの表現型の誘導のためのサブスレッシュホールドであるメチオニン濃度を決定することをお勧めします。 </li><li>標準的な滅菌技術を使用して滅菌コニカルフラスコ中のメチオニン0.2と選択培地の50mlに最近形質転換細胞と接種を含むプレートから六コロニーを選択してください。 30℃で一晩200 rpmで振とうしながらのCをインキュベートする。（標準的な酵母の培養条件の詳細については、文献4参照） </li><li>翌朝、600nmの時の文化の光学密度を測定することにより見積もりの​​細胞密度。室温で5分間に2200 rpmで回転することによって滅菌遠心管と収穫に細胞の20 OD 600nmのに相当するものを転送する。 </li><li>に再懸濁し、細胞は0.4 OD 600nmの / mlの濃度でYPDとDMSOの1mg/mlのストックからの15μg/mlの最終濃度にノコダゾールを追加。 200rpmで振盪しながら30℃で4時間インキュベートする。 注：α- factorを使ってG0期でまたはヒドロキシウレアを使用してG1 - S期で停止を含む代替逮捕の方法を使用することができる。我々は、ノコダゾールを使用して有糸分裂で逮捕はシンプルで私たちの目的のために十分有効であることを見出した。 </li><li> 4時間後、顕微鏡下に表示することによって、同じサイズの芽を持つ細胞の数をカウントすることによって有糸分裂で逮捕された細胞の割合を確認してください。逮捕が90％を超える場合は、以下の手順に進みます。有糸分裂停止の希望する割合が達成されるまでそれ以外の場合、ノコダゾールで細胞を維持する。 </li><li> 5分2200 rpmで遠心分離によって細胞を回収し、氷冷水で3回洗浄する。最終洗浄後、〜0.5 OD 600nmの / mlの細胞密度でメチオニンを欠く選択培地でペレットを再懸濁します。新しい滅菌チューブに細胞の半分の量を転送し、最終的な0.2mmの濃度にメチオニン追加。これは、タンパク質発現の基底レベルによる影響のためのコントロールとして機能します。これは、実験の最初の時間ポイント（時間= 0H）をマークします。細胞を6時間毎時間を分析する。 </li></ol>表現型の開発のB.解析 注：以下で説明するすべての分析手法を同時に実行する必要はありません。 ウェスタンブロッティングによりタンパク質の発現レベルの決定<ol><li>毎回ポイントで、5分に2200 rpmで遠心分離による細胞の培養と収穫2 OD 600nmの同等のOD 600nmのを測定する 。 </li><li> 1ミリリットル滅菌水でペレットを再懸濁し、1.5ミリリットルのエッペンドルフチュー​​ブに懸濁液を移す。ペレットを得るために遠心操作を繰り返します。上清を吸引除去する。 </li><li> 50μlのSDS - PAGE Laemmliサンプル緩衝液（50mMトリスpH6.8で、2％SDS、10％グリセロール、2％β-メルカプトエタノールと0.006％ブロモフェノールブルー）でペレットを再懸濁する。酸洗浄ガラスビーズ（0.2から0.4ミクロンの直径）と1分間ボルテックス50μlのを追加。 </li><li> 95℃熱BLO上でチューブを沸かし2分のためのCK、30秒のため、再度ボルテックスし、5分間煮沸再開。 -20℃でタンパク質試料を凍結</li><li> 、12％SDS - PAGEゲル上でタンパク質サンプルを実行するニトロセルロース膜に転写し、目的のタンパク質を検出するために適切な抗体を用いたウェスタンブロッティング行います。この例では、我々はBlotto中- Tweenでの1:2000希釈（1XPBS、5％脱脂粉乳でマウス抗HA抗体（Covance、プリンストン、NJ）でインキュベートすることにより、ENTHドメインをタグ付けヘマグルチニン（HA）の存在を探る、0.1％のTween）。またBlotto中 - トゥイーンで、1:2500の希釈でヤギ抗マウス二次抗体（Pierce）をタグ付きHRPは、室温で1時間のための膜に一次抗体を結合させています。 Supersignalウエストのピコ化学発光基質は、HRPタグ付けされた抗マウス抗体を検出するために使用されます。 </li><li>デンシトメトリーによるタンパク質の発現レベルを定量化する。 </li></ol>このセクションでは、増加するタンパク質濃度の関数として追跡する表現型の開発の2つの方法について説明します。最初のメソッドは、単一細胞のレベルの第2の研究にしながら、細胞集団に基づいています。 細胞分裂の表現型と細胞死の定量化<ol><li>各タイムポイントで、5分に2200 rpmで遠心分離によって滅菌技術と収穫の細胞を用いて滅菌エッペンドルフチュー​​ブに1ミリリットルの細胞懸濁液を移す。 </li><li>上清を吸引除去し、滅菌水で1mg/mlのストックから、ブルー30μlのメチレンブルー続いて70μlのメディアでペレットを、懸濁します。メチレンブルーは、従って死んだ細胞は、その青い色で識別可能な細胞質ゾルの還元性環境で無色になる青生体染色色素である。 </li><li>ピペット〜きれいなガラススライド上にこの懸濁液6μlとドロップを介してカバースリップを配置。ガラスのインターフェイス間で細胞の薄く均一な層を形成するために静かにカバースリップを押してください。 </li><li> 9象限にカバースリップを分割し、図に示すように象限ごとに3の画像を取る。 2。細胞/フィールドの数は、正確な定量を可能にするために30セルよりも大きくすべきではありません。気泡が準備を損傷する前に、各カバースリップは、約15分間撮像することができます。 </li><li>研究対象の表現型を示す細胞の数を数えます。 ENTH2過剰発現により誘導される細胞分裂の欠陥は、細胞死につながる、それゆえ、我々はまた、青の色で識別される死細胞の数を数えます。 </li><li>表現型の細胞の割合を計算する。 </li><li>図に示すようにデータをプロットします。 3。 </li></ol>蛍光顕微鏡を用いて表現型固有の欠陥の可視化としてENTH2過剰発現時に見られる細胞分裂欠陥のある細胞は、しばしば細胞壁の欠陥とセプチンmislocalization3（GFP -融合タンパク質として可視化）によって特徴付けられる。出芽酵母の細胞壁は簡単に酵母細胞壁にキチンに不可逆的に結合するCalcofluorホワイト（CFW）での染色により可視化することができます。 <ol><li>滅菌エッペンドルフチュー​​ブと収穫細胞における文化のたびにポイント、アリコートの1ミリリットルで、室温で5分間2200 rpmで遠心分離によって。 </li><li>暗所で室温で5分間滅菌水とインキュベートで1mg/ml CFWソリューション液100μlに細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>遠心分離によって細胞を回収し、1X PBSで3回洗浄する。 </li><li> 100Xの倍率で100μlの1X PBSでペレットとUV光学系を用いて顕微鏡下での画像（細胞壁）とFITCフィルター（GFP -セプチン）を再懸濁します。 </li><li>セクションB.2.1で、次の手順4-6で細胞壁の欠陥とセプチンmislocalization持つ細胞の割合を定量化</li></ol> B.3。タイムラプスビデオ顕微鏡：単一細胞レベルでの表現型の開発の決定。 <ol><li> 70％アルコールと凹面のうつ病とスライドガラスを清掃し、空気乾燥することができます。 </li><li>アガロースが完全に溶けるまで電子レンジで滅菌ガラスチューブ内にメチオニンを欠く5ミリリットル選択培地で0.06グラムアガロースを煮る。 </li><li>迅速にピペットスライドうつ病のアガロース含有培地200μlのとそれ以上の別のきれいなガラススライドを反転させ、空気の泡が下敷きにされていないことを確認すること。 </li><li>ゲルが固化するとき、常にその面が平行に保ち、スムーズに離れてうつ病のスライドから上にスライドを移動する。これは、アガロースの床の表面は、うつ病のスライドの表面と同じ高さであることを保証します。繊細な組織でアガロースのベッドを囲むスライド領域を清掃してください。スライドを使用する準備が整いました。 </li><li>時= 4時間、室温で5分間2200 rpmで遠心分離により培養液から滅菌エッペンドルフチュー​​ブと収穫へのセルの転送1ミリリットル。 注：これは、その表現型の開発が保証されているので、時間の点後は、タンパク質発現の高いレベルを確保するために選択することをお勧めします。パイロット実験を決定する際に必要です。ケースバイケースで、電子誘導時間を。 </li><li>メチオニン不足して新鮮な選択培地100μlの上清と再懸細胞を吸引除去する。 </li><li>カバースリップの端にワセリンを塗布。その後、アガロースのベッドの中心に細胞懸濁液のドロップを配置し、静かにその上にカバースリップを押すことによって一様に広がる。 </li><li>ワセリンでカバースリップの端をシールし、マニキュアでのエッジの内側を覆うことによって、その位置を固定。マニキュアが乾くまで待ちます。 </li><li>顕微鏡の加熱ステージ上でスライドを配置し、十分な間隔10以上のセルを含むフィールドを選択してください。細胞が分裂するように、フィールドは、時間の経過とともに混雑してしまいます。 </li><li>フィールドの画像〜5時間、5分ごとにかかります。表現型の進行は、ImageJのソフトウェアを（使ってムービーに画像を組み立てることで調べることができます<a name="cite">Rasband、WS、ImageJは、保健、ベセスダ、メリーランド州、アメリカ、http://rsb.info.nih.gov/ij/、1997年の米国国立研究所-2005</a> ） </li></ol> 注：我々はツァイスAxiovert 200M顕微鏡を使用して、ツァイスAxiocam MRMは、デジタルカメラと生細胞イメージングのためのカールツァイスAxioVisionの画像収集ソフトウエア（バージョン4.4）モノクロ。温度制御は、PeCon Tempcontrol 37デバイスで30℃に維持加熱ステージ上でスライドを配置することによって達成されます。 繰り返しフォーカスを再調整を避けるために、それは自動的にすべての時間の時点でいくつかのZスタック画像を取得し、ムービーを組み立てる際、後で最良の焦点で画像を選択する画像取得ソフトウエアをプログラムするのに便利です。いくつかの画像取得ソフトは、時間経過実験のためのオートフォーカスのオプションがあります。それはときに利用でそのオプションを使用すると便利です。 野生型酵母細胞は、30で最高の成長° Cしたがって、温度制御が重要です。十分な熱を確保するためには、加熱された段階に加えて、熱の外部ソースを提供するために便利です。例えば、我々は、イメージングの全期間に顕微鏡の透過白色光のまま。 また、アガロースのベッドと細胞のサンドイッチを準備する際に気泡を避けるために重要です。気泡内に閉じ込められた空気は、時間をかけて加熱すると膨張し、離れて撮像されてフィールドから細胞をプッシュする傾向がある。 それは、特に再フォーカスの試行中に、そのフィールド内の各セルの位置が画像のプロセスの期間にわたってかなり変更されないようにすることも重要です。映画を組付けた後、ImageJはセルの位置に小さなシフトを是正するための画像安定化プラグインが用意されています。 （ <a href="http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html">http://www.cs.cmu.edu/〜伉儷/コード/ Image_Stabilizer.html</a> ）。

<ol>
	<li>R&#246;nicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+conditional+promoters+for+expression+of+heterologous+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach. , 121-134 (1994).</li><li>Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endocytic+protein+Epsin+2+functions+in+a+cell-division+signaling+pathway.">The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway.</a> J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).</li><li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology. , 3-21 (1991).</li></ol>

このプロトコルは、タンパク質の過剰発現時に形態学的表現型（適切な細胞分裂を受けることができない酵母細胞）の開発を監視する方法について説明します。この手順を行うときは、それより速いスピードで細胞や不明瞭な結果を傷める可能性がありますので、推奨遠心速度で沈殿させ、酵母細胞を採取することを忘れないことが重要です。メチレンブルーとCalcofluor白は、それらが有毒で...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Nocodazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO)</td>
<td>M1404</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methylene Blue 1% (w/v)</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR International</td>
<td>VW6276-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcofluor White</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO)</td>
<td>F3543</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petroleum Jelly</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR International</td>
<td>VW3339-2</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of the development of a morphological phenotype as a function of protein concentration in budding yeast

遺伝子欠失と蛋白質の過剰発現は、タンパク質の機能を研究するための一般的な方法です。この記事では、我々は、人口および単一細胞レベルでのタンパク質の濃度の関数として表現型の開発の分析のためのプロトコルを記述する<em&gt;サッカロマイセスセレビシエ</em&gt;。このプロトコルは、タンパク質の過剰発現に基づいていますが、それは容易にタンパク質発現の抑制に依存する形態学的表現型に適合させることができる。私たちの研究室では、エンドサイトーシスのアダプタータンパク質のepsinのシグナル伝達特性の研究に興味を持っています。その目的のために我々が保存を過剰発現しているドミナントネガティブアプローチを使用<u&gt; E</u&gt; psin<u&gt; N</u&gt; -<u&gt; T</u&gt; erminal<u&gt; H</u内因性epsin - 2（Ent2またはYLR206W）の機能と干渉するために&gt; omology（ENTH）ドメイン。我々は、足場タンパク質、septinsの家族のmislocalizationに依存している細胞分裂の欠陥につながった野生型細胞でEnt2（ENTH2）のENTHドメインの過剰発現を観察した。

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast at JoVE.com

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

遺伝子欠失と蛋白質の過剰発現は、タンパク質の機能を研究するための一般的な方法です。この記事では、我々は、人口および単一細胞レベルでのタンパク質の濃度の関数として表現型の開発の分析のためのプロトコルを記述する<em&gt;サッカロマイセスセレビシエ</em&gt;。

出芽酵母のタンパク質濃度の関数としての形態学的表現型の開発の分析

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

analysis-development-morphological-phenotype-as-function-protein

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K ビュー.  Purdue University. 遺伝子欠失と蛋白質の過剰発現は、タンパク質の機能を研究するための一般的な方法です。この記事では、我々は、人口および単一細胞レベルでのタンパク質の濃度の関数として表現型の開発の分析のためのプロトコルを記述するサッカロマイセスセレビシエ。

ビデオ: Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

ラットの歩行の質的分析のための方法としてRotorodの使用

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

生物学

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

出芽酵母の複製寿命の測定

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

速度論と構造機能解析のアフィニティ定量のための適切なタンパク質濃度の重要性

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

大人のゼブラフィッシュの腎臓におけるネフロン構成と機能の解析

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

出芽酵母におけるエンドサイトーシスの定量的、動力学的およびハイスループット分析のためのpHluorinの応用

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

出芽酵母における高解像度画像と個人アストラル微小管動態の解析

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...