我々は彼らのサポートのためにカーシャーラボのすべてのメンバーに感謝します。私たちは、酵母株MHY3765用マークHochstrasserに感謝します。この作品は、NSFの助成金1051970（OK）に、ハワードヒューズ医学研究所学部旅行助成とモンロー学者プログラムグラント（ESへ）によってサポートされていました。

変性条件下で出芽酵母細胞で発現6xHisタグタンパク質の精製 1。タンパク質発現の酵母細胞と誘導の成長 （2から変更） オプション：関心の代わりに後述のガラクトース誘導性の文化のタンパク質を発現対数的に成長している酵母培養を使用してください。 <ol><li>ギャル+コードするプラスミドで酵母株の選択のガラクトース誘導性6xHisタグタンパク質の細胞を形質転換する。例えば、試薬のリストを参照してください。 </li><li> 2％ショ糖を含む適切な選択培地（ 例えば SD-ウラシル）5ml中の形質転換体を植菌。 30°CO / N、回転でインキュベートする。 </li><li> 600nmでの光学密度が2％ショ糖と選択培地33 mlの0.3（= 0.3 OD 600）を測定するようにO / N文化を希釈します。 （Δ150rpm）で揺れ、30℃で成長する。 </li><li>文化は、OD 600 = 0.8に達したとき-1.5、2％ガラクトースの1x YEPの最終濃度が、6％ガラクトース（ 表1のレシピ）で3回17mlのYEPを添加することにより、所望のタンパク質の発現を誘導する。合計培養液量は現在50ミリリットルです。インキュベートし、追加の5-6時間、30℃で、揺れ。 注：培養液量を変化させることができる。ステップ1.3で、希薄所望の最終体積の三分の二に。ステップ1.4では、3倍YEP / 6％ガラクトースの三分の一、最終容量を追加します。 </li><li> 4℃で5,000 rpmで5分間誘発文化や遠心分離機、細胞のΔ150-200 OD 600単位のOD 600を測定します</li><li> 1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルと2 mlのスクリューキャップチューブに移すと1ミリリットルの氷冷1X PBSで再懸濁し、細胞ペレット。 </li><li> 4℃で15,000 rpmで1分間遠心し℃で上清をデカント。 </li><li> -80℃で即時細胞溶解またはストレージが続く液体窒素、℃でさらに使用するまで、Cで凍結細胞ペレットをスナップ。 </li></ol><ol><li>前のステップからの凍結細胞ペレットに、酸洗浄ガラスビーズと氷冷溶解バッファー（ 表1のレシピや、選択した細胞溶解バッファーを使用します）500μlの200μlのを追加します。 </li><li>簡単に言うとペッティング上下。これは完全に細胞ペレットを再懸濁する必要はない。すべての回で氷の上にチューブを保管してください。 注：ピペットチップの先端が上下にピペッティング前に切断されることがあります。 </li><li> 4℃で、場所ビーズミル、バランス、ロック、そして当たり製造元の指示としてマシンを実行中に細胞とチューブ（秒）。 </li><li> 5.5で20秒間チューブ（s）を含むビーズビーターメートル/秒、その後1分間ぬかるみ氷上に置きを実行します。合計で6倍を繰り返します。 </li><li> 4℃15,000 rpmで15分間、℃で遠心分離により抽出したタンパク質をクリアオプション：SpinXフィルターを通して遠心分離により小さな微粒子を除去。 </li><li>全細胞eのサンプルを準備しますウェスタンブロットによって目的のタンパク質の存在を確認する（WCE）xtract： <ol><li> 800μlの20％トリクロロ酢酸（TCA）への細胞の2 OD 600台（クリアエキス例えば 、5μlの細胞の200 OD 600台が収穫されている場合）に対応するWCE追加。ミックスする渦。 </li><li> 4℃で15,000 rpmで2.5分間遠心上清をデカントしたが、ペレットを保持するように注意してください。 </li><li> 4℃15,000 rpmで2.5分間遠心分離し、ペレットとボルテックスチューブにTCA 2％800μlの、℃までを追加上清をデカントしたが、ペレットを保持するように注意してください。 </li><li> TCAサンプルバッファー100μlの（ 表1のレシピ）、ペレットを溶解するために渦を追加します。注意：サンプルバッファがペレットに添加した後（黄色に変わります）、酸性になった場合、Δ10μlのトリス塩基のアリコートを追加[1M]サンプルは再び青になるまで。 </li><li> 2-5分間100℃のヒートブロックでインキュベートする。 </li><li>渦AGAINペレットの残党がまだ存在する場合は、完全に溶解する。この方法で調製したペレットは、完全に溶解するの難しいことで知られています。それは完全にペレットを溶解するためにボルテックスのΔ10分かかる場合があります。 </li><li> -80 Storeサンプル°C、さらに使用するまで。 </li></ol></li><li>さらに使用するまで-80℃で液体窒素や店舗内の残りのクリアWCE°Cのアリコートを凍結スナップ。 </li></ol> 3。酵母細胞ホモジネートからのタンパク質のバッチ精製注：この精製法は、Co 2 +金属アフィニティー樹脂に6xHisタグタンパク質の精製の ​​ために最適化されました。 <ol><li> レジン平衡 <ol><li>細胞のΔ20-40 OD 600台から調製クリアWCEのサンプルについては、マイクロ遠心チューブに親和性樹脂の50〜100μLを加える。例えば、アミロース、所望のタンパク質または非特異性樹脂を発現しない細胞から抽出したタンパク質を、コントロールとして使用することができる非特異的結合のための。 </li><li>洗浄緩衝液1mlで5倍の樹脂を洗う：トップオーバーボトム反転樹脂を再懸濁させた後、4℃で5,000 rpmで1分間スピンするまで℃に上清を吸引。 注：同じ日に抽出·精製を行う場合は、樹脂平衡化、抽出の前に行うことができる。 </li></ol></li><li> アフィニティー精製の ​​ためのタンパク結合 <ol><li> 50〜100μlの洗浄したビーズにクリアライセート100-200液（Δ20-40 OD 600単位）を追加し、溶解緩衝液で1ミリリットルの合計容積をもたらす。 </li><li> 2-5時間で4章動またはロッキング°Cでインキュベートする。 </li><li> 4℃で5,000 rpmで1分間スピン</li><li>必要に応じて、非結合タンパク質のその後の分析のために残りの上清のサンプルを保存します。 TCAはWCE（ステップ2.6）については、上記の詳細として沈殿する。 </li><li> 5,000 rpmで少なくとも1分間スピンコートした後、洗浄緩衝液1mlで5倍の結合タンパク質で樹脂を洗浄4℃洗浄中にサンプルは冷やしておく。 </li></ol></li><li> 結合したタンパク質の溶出 <ol><li> 4で、樹脂にうなだれるを150μlの溶出バッファーを追加℃で5分間、4℃で5,000 rpmで1分間スピン℃、新しいチューブに上清を保存します。オプション：2倍とプール溶出を繰り返します。 </li><li> 、溶出したタンパク質の25μlに2μlのβ-メルカプトエタノール（BME）と25μlの2倍のリチウムドデシル硫酸塩（LDS）サンプルバッファーを加え、2分間100℃のヒートブロックでインキュベート：ウェスタンブロット用溶出サンプルを準備します。 注：標準2XのLaemmliサンプル緩衝液を用いてもよい。 </li><li>液体窒素中で凍結過剰溶出タンパク質をスナップ。 オプション：65℃2倍LDSサンプルバッファー等量と樹脂からのストリップの残りのタンパク質は℃で5分間、新しいチューブにLDS-溶出タンパク質を除去し、ではない樹脂に、溶出したタンパク質に2μlのBMEを追加します。この順序は、抱合あるあらゆるイオンまたは抗体の除去を防止するためであるビーズにテッド。 </li><li> -80℃でさらに使用するまで、店舗のサンプル。 </li></ol></li><li> タンパク質を可視化するための適切な抗体を用いたウェスタンブロットおよびプローブ 。 <ol><li>各サンプルの10〜20μL（Δ1-3 OD 600台）と、選択したSDS-PAGEゲル中のタンパク質ラダーの3-10μLをロードします。日常的にこのプロトコルに使用ゲルは4〜12％ビス - トリス、8％トリス - グリシンが含まれています。 </li><li> 50分間200 Vでゲルを実行します。 </li><li> 20〜30分（ 表1のレシピ）が19 Vでセミドライ転送によりゲルからPVDF膜にタンパク質を転送します。 </li><li> 4％milk/1xトリスのブロック膜は、4℃（ 表1のレシピ）でRTまたはO / Nで1時間食塩水TWEEN（TBST）をバッファリング。 </li><li> 4℃でRTまたはO / Nで1-3時間、4％milk/1xのTBSTの関心のエピトープタグタンパク質に一次抗体を有する膜をインキュベート</li><li> 1×TBSTで5分間ごとに、3倍の膜を洗浄します。 </li><li>適切なメンブレンをインキュベート二次西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合室温で1-3時間、抗体。 </li><li> 1×TBST大容量で15分ごとに、3倍の膜を洗浄します。 </li><li>サランラップでECL基質とラップでメンブレンをカバーしています。 </li><li>フィルムに膜を露出させ、タンパク質を可視化するために開発しています。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+construction+inSaccharomyces+cerevisiae.">Cell wall construction inSaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (3), 185-202 (2006).</li><li>Gelperin, D. M., White, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection.">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes Dev. 19 (23), 2816-2826 (2005).</li><li>Caserta, E., Haemig, H. A. 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T., Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+SUMO-modified+proteome+by+multiple+approaches+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Defining the SUMO-modified proteome by multiple approaches in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 280 (6), 4102-4110 (2005).</li><li>Xie, Y., Rubenstein, E. M., Matt, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-independent+in+vivo+activity+of+a+SUMO-targeted+ubiquitin+ligase+toward+a+short-lived+transcription+factor.">SUMO-independent in vivo activity of a SUMO-targeted ubiquitin ligase toward a short-lived transcription factor.</a> Genes Dev. 24 (9), 893-903 (2010).</li><li>Daum, G. G., B&#246;hni, P. C. P., Schatz, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Import+of+proteins+into+mitochondria.+Cytochrome+b2+and+cytochrome+c+peroxidase+are+located+in+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria.">Import of proteins into mitochondria. Cytochrome b2 and cytochrome c peroxidase are located in the intermembrane space of yeast mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 257 (21), 13028-13033 (1982).</li><li>Deutscher, M. 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T. M., Cox, L. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+affinity+of+cholera+toxin+for+Ni2++ion.">The affinity of cholera toxin for Ni2+ ion.</a> Protein Eng. 11 (7), 577-581 (1998).</li><li>Hautbergue, G. G., Goguel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+C-type+cyclin+Ctk2p+is+phosphorylated+and+rapidly+degraded+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway.">The yeast C-type cyclin Ctk2p is phosphorylated and rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Mol. Cell. Biol. 19 (4), 2527-2534 (1999).</li><li>Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumo-dependent+substrate+targeting+of+the+SUMO+protease+Ulp1.">Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1.</a> BMC Biol. 9, 74 (2011).</li><li>Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Hex3.Slx8+heterodimer+is+a+ubiquitin+ligase+stimulated+by+substrate+sumoylation.">The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation.</a> J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルは、無傷の、ネイティブの準備に焦点を当て、翻訳後のダウンストリームアプリケーションのため出芽酵母細胞からタンパク質を変更しました。このプロトコルを試みる前に、目的のタンパク質を容易に変性条件下12で調製したタンパク質抽出物中で検出することができるかどうかを判断することが重要である。ポリクローナル抗体が利用できない場合、それは、融合...

酵母遺伝学の素晴らしいパワーは伝説ですが、出芽酵母、 サッカロマイセス·セレビシエ、から天然タンパク質の調製及び分析は、多くの場合、問題をはらんでいます。後者は、酵母細胞壁1のかなりの機械的強度及び弾性のためである。別の手段は、酵素的、化学的、機械的、圧力ベースの全細胞タンパク質抽出物2-6を得るために、酵母細胞の破壊のために記載されている。これらの技術は、その後の分析または精製工程に使用することができる細胞代表、天然のタンパク質抽出物を得るためにそれらの効力が大きく異なる。例えば、酵母細胞壁溶解酵素（ 例えばザイモリアーゼ）、得フェロブラストで除去することができるが、剪断、界面活性剤、またはタンパク質を放出する浸透溶解によって破壊することができる。このアプローチは成功し、多くの細胞下分画するための出発点として使用されるが、それは長いインキュベーションを必要とされていますそれはいくつかのタンパク質7の安定性と互換性がありません。 酵母細胞のタンパク質の化学的抽出のための独自の酵母溶解試薬 ​​（例えば、界面活性剤など）、市販されているが、これらのタンパク質抽出における試薬およびタンパク質のその後の生化学的特徴付けに対する効果の有効性は必ずしも明らかではない8。高圧ホモジナイザーは、しばしばフランス語押下と呼ばれる、効果的に第1高圧にそれらを施し、次いで圧力セル内の小さな開口部を介してそれらを押し出すことによって酵母細胞を破壊する。この技術は、高品質の抽出物を生成したが装置は非常に高価であり、細胞または複数のサンプル9少量のに適しているわけではない。したがって、ビーズミルで酵母細胞の機械的破壊は、しばしば、天然の酵母タンパク質調製物10を選択する方法である。この技術は、酸のWAを有する酵母細胞壁の機械的破壊を伴うシェーカー、vortexersまたはビーズミルの様々行うことができるガラスビーズを流した。特に、この方法は、同時に複数のより小さな試料（1 mlの細胞以下）を処理するために使用することができる。さまざまなビーズやビーズミル混乱行列は今や2 mlのチューブに細胞型のほとんどすべての種類を妨害するために市販されている。他の技術と設備を考慮し、ビーズミル、プロテアーゼおよび/またはプロテアソーム阻害剤と適切なバッファが利用される場合は特に、例えばSUMO化などの翻訳後修飾を維持するのに役立ち、これ酵母細胞の破壊は非常に速く起こるという利点を有しているそして抽出物の温度が制御される。 このプロトコルは、内因性および過剰発現タンパク質の機能を維持するために究極の目標と穏やかな条件の下でタンパク質相互作用、および翻訳後修飾の、高速で効果的、かつ信頼性の高い抽出に焦点を当てています。増殖培地、細胞溶解バッファー組成物、及びビーズミルの設定は、タンパク質間相互作用、例えばSUMO化とユビキチン化などの翻訳後修飾を維持するために最適化される。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1039">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Omni Bead Ruptor 24</td>
			<td style="width:124px;">Omni International</td>
			<td style="width:119px;">19-010</td>
			<td style="width:580px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yeast ORF strain in BG1805</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>YSC3869</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pYES2.1 TOPO vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K4150-01</td>
			<td>GAL+ yeast strain that can be used for induction and extraction; contains a V5/6xHIS tag</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail (100x)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1860932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">2.0 ml Skirted Tube with Tethered Screw Cap</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">C-3369-3</td>
			<td>Make sure that the tube properly fits in the bead ruptor</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass beads, acid-washed, 425-600 &#181;m (30-40 US sieve)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CLS8161</td>
			<td>Use for additional filtering of clarified lysate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TALON Metal Affinity Resin</td>
			<td style="width:124px;">Clontech</td>
			<td>635502</td>
			<td>For the purification of 6xHIS tagged proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>To prepare and/or elute samples prior to SDS-PAGE and Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">NP0321BOX</td>
			<td>Precast gels often used for SDS-PAGE prior to Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Simply Blue</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">#LC6060</td>
			<td>Protein gel stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mammalian Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:119px;">G9381</td>
			<td>Alternative commercial lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-V5 agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7345</td>
			<td>Method of immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ECL</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">WBKL S0 050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PVDF membrane</td>
			<td style="width:124px;">Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BIS-TRIS gels</td>
			<td style="width:124px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti-myc antibody</td>
			<td style="width:124px;">Covance</td>
			<td style="width:119px;">mms-150R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">secondary antibody</td>
			<td style="width:124px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab97040</td>
			<td>Goat pAb to mouse IgG (HRP)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

budding yeast protein extraction and purification for the study of function, interactions, and post-translational modifications

ビーズ打つことによって均質化は、悪名高い混乱させるのは難しいです出芽酵母の細胞からDNA、RNA、タンパク質、代謝物を解放するために、高速かつ効率的な方法です。ここでは、機能的相互作用およびタンパク質の翻訳後修飾を維持するために最適化されたバッファーにタンパク質を抽出するためのビーズミル、ホモジナイザーの使用を記載している。目的のタンパク質を発現する対数的に増殖している細胞は、選択した液体増殖培地で増殖させる。増殖培地は、誘導性プロモーター（ 例えば、ガラクトース）からのタンパク質発現を誘導するための試薬 ​​を補充することができる（ 例えば 、ノコダゾール）の細胞周期段階を同期させる、または（ 例えば、MG132）プロテアソーム機能を阻害する。次に細胞をペレット化し、プロテアーゼおよび/またはホスファターゼ阻害剤を含有する適当な緩衝液中に再懸濁しており、すぐに処理されるか、後で使用するために液体窒素中で凍結される。均質化は20秒BEAの6サイクルによって達成されるD-鼓動（5.5メートル/秒）、氷上で1分間インキュベートした各。得られたホモジネートを遠心分離によってクリアされ、小さな微粒子を濾過により除去することができる。結果クリア全細胞抽出物（WCE）はウェスタンブロッティング続いSDS-PAGEによる全タンパク質の直接分析のためにTCA 20％を使用して沈殿させる。抽出物はまた、特定のタンパク質のアフィニティー精製、翻訳後修飾、または共精製タンパク質の分析の検出に適している。ほとんどのタンパク質精製プロトコルの場合と同様に、いくつかの酵素やタンパク質は、それらの精製および他のためのユニークな条件やバッファー組成物が記載された条件の下で不安定になったり、不溶性のかもしれませんが必要な場合があります。後者の場合、提示プロトコルは、経験的にタンパク質抽出および精製のための最良のビード打ち戦略を決定するために有用な出発点を提供することができる。私たちは、エピトープタグSUMO E3リガーゼ、SIZ1、細胞周期の抽出と精製を示すSlx5、SUMO化およびリン酸化と同様、SUMO-ターゲットユビキチンリガーゼのサブユニットの両方になるタンパク質を規制。

我々の代表的な結果について説明ビード打ちおよびタンパク質抽出プロトコルは、ダウンストリーム·アプリケーション（ 表2に要約）の様々なタンパク質の再現可能な製造のために有用であることを明らかにした。 WCEsのクーマシー染色したSDS-PAGEでタンパク質（〜12〜&gt; 250 kDaの）広範囲の再現性酵母細胞（ 図1A）から抽出することができることを示している。分?...

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Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

高品質の酵母細胞抽出物の調製は、個々のタンパク質または全体プロテオームの解析に必要な最初のステップである。ここでは、タンパク質機能、相互作用、および翻訳後修飾を維持するために最適化された出芽酵母細胞のための、高速で効率的、かつ信頼性の高い均質化プロトコルが記載されている。

機能の研究、相互作用、および翻訳後修飾のため出芽酵母タンパク質の抽出と精製

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

budding-yeast-protein-extraction-purification-for-study-function

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Biology

24.8K ビュー.  The College of William & Mary. 高品質の酵母細胞抽出物の調製は、個々のタンパク質または全体プロテオームの解析に必要な最初のステップである。ここでは、タンパク質機能、相互作用、および翻訳後修飾を維持するために最適化された出芽酵母細胞のための、高速で効率的、かつ信頼性の高い均質化プロトコルが記載されている。 

ビデオ: Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

出芽酵母の複製寿命の測定

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

生物学

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

出芽酵母のタンパク質濃度の関数としての形態学的表現型の開発の分析

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

ELISAによるネイティブ無傷ヌクレオソーム上の翻訳後修飾の検出

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

タンパク質-DNA相互作用の研究のための単一分子マニピュレーションとイメージングを組み合わせる

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

タンパク質相互作用を発見したHaloTag技術を用いたタンパク質機能の特性評価

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

出芽酵母動原体タンパク質Ndc10とNdc80のSUMO化とユビキチン化の検出を可能にするタンパク質の精製技術

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone function is mediated by extensive post-translational modification by a myriad of nuclear proteins. These modifications are critical for nuclear integrity as they regulate chromatin structure and recruit enzymes involved in gene regulation, DNA repair and chromosome condensation. Even though a large part of the scientific community adopts antibody-based techniques to characterize histone PTM abundance, these approaches are low throughput and biased against hypermodified proteins, as the epitope might be obstructed by nearby modifications. This protocol describes the use of nano liquid chromatography (nLC) and mass spectrometry (MS) for accurate quantification of histone modifications. This method is designed to characterize a large variety of histone PTMs and the relative abundance of several histone variants within single analyses. In this protocol, histones are derivatized with propionic anhydride followed by digestion with trypsin to generate peptides of 5 - 20 aa in length. After digestion, the newly exposed N-termini of the histone peptides are derivatized to improve chromatographic retention during nLC-MS. This method allows for the relative quantification of histone PTMs spanning four orders of magnitude.

This protocol outlines a fully integrated workflow for characterizing histone post-translational modifications using mass spectrometry (MS). The workflow includes histone purification from cell cultures or tissues, histone derivatization and digestion, MS analysis using nano-flow liquid chromatography and instructions for data analysis. The protocol is designed for completion within 2 - 3 days.

ヒストンの抽出からデータ解析まで：ボトムアップ質量分析法を用いてヒストンの翻訳後修飾の解析のための完全なワークフロー

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

出芽酵母におけるエンドサイトーシスの定量的、動力学的およびハイスループット分析のためのpHluorinの応用

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...