私たちは、ミトコンドリアの形態を達成すると、セル負荷プロトコルとマーカス·デGoffauとGuille Zamparの最初のバージョンを作成するためのローラのシッパーズに感謝したいと思います。

1。シリコンウェーハモールドの生産と準備マイクロ流体チップは、ソフトリソグラフィーによって生成されたシリコンウェハ型から作成される。これらのウェーハは、マイクロ流体チップを製造するために何回も再使用することができる。それはそれぞれのウェハの製造はマイクロフルイディクス6に特化した基により行われることが望ましい。 ウェハはネガ型フォトレジスト二つの異なる層、SU-8 7を用いた2段階フォトリソグラフィ工程で行われる。チャネルは、最上層（;高さ10μmのSU-8 2010）で作られているのに対し、;底層が細胞捕捉領域（高さ3-4μmのSU-8 2002）を生成するために使用される。ウェハ製造プロセスの印象がHuang ら 8に見出すことができる。マイクロ流体チップの図面は著者と同様に、それぞれのウェーハを取得する方法についてのアドバイスから得ることができる。 <ol><li>ウェハが得られると、タフタグintの一枚をカットメスと入口チャネルとmicropad配列（ 図2A）との間のチャネル構造の上にわずかにウェハ上に慎重に置きますと3ミリメートルで約0.5mmのO薄いストリップ。これは、セルのロード中に使用されることはありませんそれぞれのチップに大きな追加チャネルの形成をもたらすが、マイクロ流体デバイスの安定動作のためにも重要であろう。 </li><li>アルミ箔の二重層のガラスシャーレをカバーし、ペトリ皿にウェハを置く。アルミ箔は、ウエハとペトリ皿の間で実行されてからPDMSを防ぐことができます。 PDMSは、ウェハやガラスシャーレの間でクリープない場合は、ウェハは、ペトリ皿に永久的に固定となります。ウェハはまだ使用可能ですが、それが壊れたときにガラスシャーレを交換することはできませんとPDMSその後切り取るする必要があります。 </li></ol> 2。マイクロ流体チップの生産<ol><li>空のプラスチックを置きバランスと風袋バランスにカップ。プラスチックカップ（直径12cmのガラスシャーレ用）に40グラムPDMSベースを注ぐ。 4ミリリットル約1:10、 すなわちのAW / wの割合で使い捨てピペットでPDMS硬化剤を追加します。 </li><li>数分間徹底的にPDMSと硬化剤を混ぜる。これは、硬化剤をピペットするために使用された使い捨てプラスチックピペットを用いて行うことができる。それは混合物が十分にウエハの上に注ぐ前に混合することが重要である。悪い混合は重合しないPDMSの一部の原因となります。 </li><li>ガラスシャーレにおけるウェハの上にPDMSを注ぐ。 </li><li>硬化剤とPDMSの混合は、PDMS混合物中の気泡形成をもたらす。これらの泡は、PDMSが重合する前に削除する必要があります。 PDMSは、真空ポンプに接続されたデシケーター中でペトリ皿を配置することにより、ウエハの上に注ぐ後に脱気することができる。このセットアップでは、混合物からすべての気泡を除去するために約30分かかります。 </li><li>重合番目さらに1時間65℃で、その後1時間と、120℃のホットプレートの上にウェハとペトリ皿を配置することによって、電子PDMS。 </li><li>ガラスシャーレからウエハと重合PDMSと一緒にアルミホイルを外します。アルミ箔とウェハの背面から重合したPDMSの薄い残留層をはがし。ウェハの上にPDMSの層を慎重に持ち上げて、ウエハから分離​​することができる。 </li><li>ベンチの上に逆さまに（上向きにチャンネル）PDMS層を置き、メスで慎重にPDMSに刻印シングルチップ設計を切り取る。後でカバーガラスへのチップの取り付けを改善するためのチャネルのエッジの周りにPDMSの約3ミリメートルを保持するようにしてください。 </li><li>ストレートな方法でPDMSを介してすべての道20ゲージルアースタブを押して入口、出口及びサイドチャネル（ 図2A）の末端PDMSにパンチ穴を開けます。 </li></ol> PDMSチップを確認してください穴をパンチしながらまだベンチに逆さまに横たわっている。これは、チャネルの閉塞を引き起こす可能性チャネルの内側に付着PDMSを防ぎます。 <ol start="9"><li>各穴をパンチした後、再びスタブを抜く前に、ピンセットでルアースタブにPDMSの列を削除します。 PDMS列は、他の背後に滞在し、ちょうどパンチ穴をブロックすることができます。 </li><li>その上にセロハンテープを配置し、直ちに再びテープを除去することにより、ダスト粒子と残留PDMSからチップの表面を清掃します。同様にチップが添付されますようにカバーガラスを清掃してください。 </li><li>卓上型UV-オゾンクリーナーのUVランプ下洗浄チップとカバーガラスを置きます。一緒に結合する必要がある側面がランプに直面しなければならない。 </li><li> PDMSを露出させ、6-8分間UV光にガラスをカバーし、その後直接互いの上に露出面を配置することによって、カバーガラス上にチップを置く。 </li><li>優しくチップの側面の周りにタップカバーガラスにPDMSの付着を促進し、気泡を除去した。これはmicropadsも同様にカバーガラスに取り付けるために原因とチャネル構造の上でタップしないでください。 </li><li> 60分間100℃のホットプレート上で、新たに作られたマイクロ流体セットアップを置きます。少しPDMSチップのエッジを持ち上げることを試みることによって、カバーガラスとPDMSチップの間の結合の強さをテストします。 PDMSブロックがガラス表面から持ち上げることができない場合は、結合が成功し、チップを使用する準備ができている。 </li></ol> 3。セルの読み込みのためにチップを準備するマイクロ流体デバイスの故障は、潜在的に顕微鏡に媒体の漏洩を引き起こす可能性があります。これを回避するためには、金属ホルダ及び/又は使用PDMSはマニキュア又はエポキシ接着剤でガラスを満たすチップの側面を封止する勧告である。 PDMSチップがカバーガラスに十分に接着されていない場合には、これは、媒体の漏れを防止する。また、チューブ接続は、媒体の漏れを回避するために、同様の方法で、挿入点の周囲に確保することができる。漏れの場合、シリンジポンプのスイッチを切り自家製水センサーは余分な安全対策として使用できます。特に、マイクロ流体チップ用に設計された金属ホルダの図面は、著者から得ることができる。 <ol><li>チップのガラスと防水シールを作成するためのホルダーの金属部分の間にシリコーンゲルで、金属製のホルダーにマイクロ流体チップを置きます。ガラスを壊さないように、静かにナットをねじ込みます。 </li><li>細い管（ 約 5〜15センチメートル長い）サイドチャネルチップの出口チャネルに接続します。ピンセットを使用することは、簡単にパンチ穴にチューブを挿入することができる。 </li><li>培地で50ミリリットルルアーロックシリンジを埋める、注射器から空気を除去し、シリンジフィルター、20ゲージルアースタブ、短い太管（ 約長さ2cm）と細い管に順次接続します。ていることを確認し、薄い浴槽eはシリンジポンプおよび顕微鏡ステージとの間の距離に及ぶことが十分な長さである。 </li><li>細い管が完全培地で満たされるまで早送り、シリンジポンプ、ポンプを注射器を置きます。 </li><li>チップの入口チャネル内にシリンジに接続細いチューブを押して、10μL/分（ 図2B）でのチップを通して培地を流す。チップ（ペトリ皿になど ）を残し培地を収集します。大型サイドチャネルと出口チャネルを作ったタフ·タグ間の抵抗差のため、媒体は、サイドチャネルを介して実行されます。 </li><li>顕微鏡ステージにチップを置き、パッド上顕微鏡のフォーカスを設定。 </li></ol>オイルは、実験の時間経過にわたって乾燥されないため、油浸対物レンズの使用は、水浸対物レンズとより好ましい。 顕微鏡に応じてfは保持に問題がある可能性があります実験の最初の時間の間にocus。それは、細胞をロードし、実験を開始する前に、落ち着くことができますので、顕微鏡のステージで1〜2時間のためにチップを残しすることをお勧めします。 4。マイクロ流体チップに酵母細胞のロード<ol><li> 20ゲージルアースタブと太管（ 約 3センチメートル）に5ミリリットルルアーチップシリンジを接続します。 </li><li>チップにロードされる細胞培養のサンプルを取る。 </li></ol>ローディングのための好ましい細胞数は、1mlあたり1〜5×10 6細胞の間である。高い細胞数との文化は、ロード前に希釈する必要があります。細胞を最初に水で洗浄し、ローディング前に同様のグルコース割合を含有する最少培地に再懸濁されている場合にYPD培養細胞は、細胞の積載効率が何倍も向上させることができるとき。チップの動作時には、YPD培地を再度安全に使用することができる。 <ol start="3"><li>目に細胞懸濁液の約1ミリリットルをロードeは、注射器と注射器からすべての空気を除去する。 </li><li> 0.5μL/ minにシリンジポンプの流量を減少させる。ロード中に、シリンジポンプ（ステップ4.5）によって強制低いと継続的流れは、サイドチャネル（ 図2C）を経由して非付着細胞を押し出します。 </li><li>出口チャネルのチューブに細胞懸濁液の入った注射器を接続する。優しく注射器のプランジャーを押してセルをロードします。入ってくると眼経由micropads下やコンピューターの画面を経由してセトリング細胞を守ってください。 </li><li>十分な細胞がパッドの下に落ち着くまで、プランジャーへの圧力を維持する。最適負荷は、パッドごとの1-3のセルです。細胞がランダムにパッドの下に落ち着くように、それはいくつかのパッドは、任意のセルが含まれていないと他のパッドが完全に細胞で満たされていることが非常に一般的です。 </li><li>セルローディングと出口チャネルの薄いチューブからそれに接続されている太管に使用注射器を外し、サイドチャンネルをフラッシュ高流量（10μL/分）で数分のためannelは、気泡および/ ​​またはまだチップ（ 図2B）を終了しなかった細胞を除去する。細胞は、サイドチャネルから除去されない場合は、サイドチャネルに成長し始めると、後に実験を妨害することができる。 </li><li>バックダウン0.5μL/ minまで、シリンジポンプの流れを入れて、その端（ 図2D）でカテーテルプラグを含む太管（ 約長さ5cm）に接続することにより、サイドチャネルを閉鎖。 </li><li> 1-5μL/分の最終的な流量に流量を増加。流量は、培地および酵母株によって異なる場合があります。 </li><li>実験の目的に適した顕微鏡やカメラの設定でムービーを開始します。顕微鏡ステージの速度は油が従うことができるような低速に設定されていることを確認します。複製寿命、画像セルごとに10分の決定のために。ハロゲンにより放出される紫外光の微量から細胞を保護するために、DIC取得中に使用されているランプは、それが光路に追加のUVフィルタを配置することをお勧めします。蛍光顕微鏡を使用する場合は、光毒性効果を回避するためにそれほど頻繁に画像細胞（20分毎など ）に好適である。実験の開始時にロードされたすべての細胞が死んでいる時に実験は通常の条件下で5日を要した、完成されています。これは、定期的に実験中の画像の焦点を確認し、必要に応じて調整することをお勧めします。 </li></ol>

<ol>
	<li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+yeast+to+discover+the+fountain+of+youth.">Using yeast to discover the fountain of youth.</a> Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1 (2001).</li><li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+span+of+individual+yeast+cells.">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li><li>Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+replicative+life+span+in+the+budding+yeast.">Measuring replicative life span in the budding yeast.</a> J. Vis. Exp. (28), e1209 (2009).</li><li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform.">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device.">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. , (2012).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. 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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+mitochondrial+fission+results+in+increased+life+span+and+fitness+of+two+fungal+ageing+models.">Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models.</a> Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).</li><li>Defossez, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+replication+block+protein+Fob1+extends+the+life+span+of+yeast+mother+cells.">Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells.</a> Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).</li><li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SIR2/3/4+complex+and+SIR2+alone+promote+longevity+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+two+different+mechanisms.">The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms.</a> Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).</li><li>Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+asymmetric+segregation+of+age+during+yeast+budding.">A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding.</a> Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).</li><li>Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+heterogeneity+in+populations+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).</li><li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast.">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li><li>Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device.">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275 (2012).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ここで説明したマイクロ流体の方法は、それが継続的な高分解能イメージングとの組み合わせで酵母複製寿命データのシンプルかつ自動生成を可能にするような研究を老化の重要な新しいツールです。これらの属性は、古典的な解剖法の実験的な可能性の上に大きな改善ですが、まだ考慮する必要がある方法のいくつかの制限があります。 micropad下に保持し、すべての?...

出芽酵母は、研究1のエージングのための重要なモデル生物である。最近、酵母細胞の老化複製を勉強するまで、各芽を手動母細胞2,3から削除された解剖の方法を必要とする骨の折れるプロセスであった。この問題を解決するために、我々は、最近、それらの全体の寿命にわたって4個々の母細胞を追跡することができる新規なマイクロ流体セットアップを提示した。 我々のマイクロ流体チップでは、酵母細胞は、エラストマーベースのソフトmicropads（ 図1参照）の下に閉じ込められている。媒体の連続的な流れは、離れて、新たに形成された娘細胞を洗浄し、新鮮な栄養素を細胞を提供する。単一の実験では、最大50の母細胞は、彼らの全体の複製寿命を通して完全に自動化された方法で監視できます。マイクロ流体チップの優れた光学的性質のために、それは同時に、酵母細胞生物学のさまざまな側面（ 例えば、監視することが可能である</em&gt;の蛍光タンパク質）を用いて。 古典的な解剖の方法に比べ、マイクロ流体セットアップはかなりの利点を提供します。それは全体の高齢化実験中に定義された、一定の環境を確保します。それは高価な特殊な機器を必要とせず、自動焦点と時間経過の能力だけでなく、細胞培養のための温度制御を搭載した任意の顕微鏡上で実行することができます。マイクロ流体チップの生産と操作は数日以内に学習することができる。さらに、細胞が対数増殖期培養直接、母細胞のビオチン化を必要とする別の最近公開されたマイクロ流体法5、以上の利点からロードすることができる。高分解能イメージング、ここに記載した方法と組み合わせることで徐々に変化を測定するために使用することができる細胞形態では、酵母中のタンパク質の発現および局在は前例のない方法で老化。のための能力単一細胞の長期モニタリングはまた、酵母細胞周期の研究のためのユニークな可能性を提供する。 この方法は、最近、この原稿が審査に入ったままの状態で公開されたプロトコル16から、ビオチンを除去するために最適化されています。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number </td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>REAGENTS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DC Sylgard 184 elastomer </td>
 <td>Mavom bv </td>
 <td>1060040 </td>
 <td>This package contains PDMS base and PDMS curing agent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Petri dishes 120/20 mm </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-2850 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cover glasses 22x40 mm </td>
 <td>CBN Labsuppliers BV </td>
 <td>190002240 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tough-Tags </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>Z359106 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aluminum foil </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic disposable cup </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Serological pipette 5 ml </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>612-1245 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scotch tape </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>819-1460 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Baysilone paste (GE Bayer silicones) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>85403-1EA </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06417-11 </td>
 <td>Referred to as thin tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD </td>
 <td>Cole Parmer </td>
 <td>EW-06418-03 </td>
 <td>Referred to as thick tubing </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scalpel </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>233-5334 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml Luer-Lok syringes </td>
 <td>BD </td>
 <td>300137 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml syringes, Luer tip </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>613-1599 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tweezers </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>232-2132 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 Gauge Luer stubs </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>LS20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe filters (pore size 0.20 &mu;m) </td>
 <td>Sigma-Aldrich </td>
 <td>16534K </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm </td>
 <td>Instech Solomon </td>
 <td>SP20/12 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petri dishes </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>391-0892 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td> EQUIPMENT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Benchtop UV-Ozone Cleaner </td>
 <td>NOVA Scan </td>
 <td>PSD-UVT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Harvard Pump 11 Elite </td>
 <td>Harvard Apparatus </td>
 <td>70-4505 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SU-8 silicon master mold (wafer) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Balance </td>
 <td>Sartorius corporation </td>
 <td>ED4202S </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vacuum pump </td>
 <td>KNF Neuberger </td>
 <td>N022 AN.18 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Desiccator </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>467-2115 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hot plate </td>
 <td>VWR International </td>
 <td>460-3267 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optional: Metal holder for cover glass (22x40 mm) </td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Self-made; For details contact corresponding author </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>Eclipse Ti-E </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast

我々は、単一出芽酵母細胞は、それらの全体の寿命にわたって追跡することができるという簡単なセットアップマイクロ流体の使用を実証する。マイクロ流体チップはmicropadsの配列を使用して母と娘細胞間の大きさの違いを利用する。 micropadとカバーガラスとの間の距離は、酵母細胞（3-4ミクロン）の直径に類似しているため、ロード時に、細胞は、これらのmicropadsの下に閉じ込められている。ローディング手順の後、培地を継続的に小さいサイズのためにパッドの下に保持されない新興の娘細胞、うち定数と定義された実験全体を通して環境だけでなく、フラッシュを作成するだけでなく、チップを通してフラッシュされます。セットアップはとても効率的に50個々の細胞まで、単一の実験では5日の完全に自動化された方法で監視されたり、必要であれば、長くすることができ母細胞を保持します。また、チップの優れた光学特性が高いことができ全体の老化のプロセスの間に細胞の分解能イメージング。

このプロトコルでは、細胞を直接中間指数培養物からマイクロ流体チップにロードされる。マイクロ流体チップに捕捉された細胞の年齢分布をロードする前培養と同様であるか否かを確認するために、細胞芽傷を可視化するためにFITCに抱合小麦凝集素（WGA-FITC）で染色した。 図3に見られるように、マイクロ流体チップのmicropads下での細胞の捕捉は、特定の年齢の細胞に付勢され...

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Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

ここではそれらの完全な複製および/または時系列の寿命の間に単一の出芽酵母細胞の連続的かつ高分解能顕微鏡イメージングを可能にするマイクロ流体装置の動作を説明する。

出芽酵母の老化複製の連続高分解能顕微鏡観察

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

continuous-high-resolution-microscopic-observation-replicative-aging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.8K ビュー.  University of Groningen. ここではそれらの完全な複製および/または時系列の寿命の間に単一の出芽酵母細胞の連続的かつ高分解能顕微鏡イメージングを可能にするマイクロ流体装置の動作を説明する。

ビデオ: Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

高分解能光ファイバMicroendoscopy用その場で細胞イメージング

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

生物工学

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography (&mu;CT).
High resolution &mu;CT is a very versatile yet accurate (1-2 microns of resolution) technique for 3D examination of ex-vivo biological samples1, 2. As opposed to electron tomography, the &mu;CT allows the examination of up to 4 cm thick samples. This technique requires only few hours of measurement as compared to weeks in histology. In addition, &mu;CT does not rely on 2D stereologic models, thus it may complement and in some cases can even replace histological methods3, 4, which are both time consuming and destructive. Sample conditioning and positioning in &mu;CT is straightforward and does not require high vacuum or low temperatures, which may adversely affect the structure. The sample is positioned and rotated 180&deg; or 360&deg;between a microfocused x-ray source and a detector, which includes a scintillator and an accurate CCD camera, For each angle a 2D image is taken, and then the entire volume is reconstructed using one of the different available algorithms5-7. The 3D resolution increases with the decrease of the rotation step. The present video protocol shows the main steps in preparation, immobilization and positioning of the sample followed by imaging at high resolution.

High Resolution 3D Imaging of Ex-Vivo Biological Samples by Micro CT

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized tomography ( CT).

の高分解能3次元イメージング生体外</emマイクロCTによる>生物試料

Non-destructive volume visualization can be achieved only by tomographic techniques, of which the most efficient is the x-ray micro computerized ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

マイカの製造は、高分解能光学顕微鏡イメージングのための脂質二重層をサポート

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

スフェロイドにおける哺乳動物細胞の大規模拡張のための連続供給することによって栄養規制

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high resolutions in live animal models. This allows for repeated imaging of the same rodent over time. This feature not only reduces the total number of rodents required in an experimental design and thereby reduces the inter-subject variation that can arise, but also allows researchers to assess longitudinal or life-long responses to an intervention. To acquire high quality images that can be processed and analyzed to more accurately quantify outcomes of bone micro-architecture, users of in vivo &#181;CT scanners must properly anesthetize the rat, and position and restrain the hind limb. To do this, it is imperative that the rat be anesthetized to a level of complete relaxation, and that pedal reflexes are lost. These guidelines may be modified for each individual rat, as the rate of isoflurane metabolism can vary depending on strain and body size. Proper technique for in vivo &#181;CT image acquisition enables accurate and consistent measurement of bone micro-architecture within and across studies.

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

This paper instructs users of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) scanners how to anesthetize, correctly position and restrain the hind limb of a rat for minimal movement during high-resolution imaging of the tibia. The result is high quality images that can be processed to accurately quantify bone micro-architecture.

適切なポジショニングと骨のマイクロ アーキテクチャを使用して体内のマイクロ-コンピューター断層撮影の焦点の高分解能イメージングのためのラットの後肢の拘束

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.

ひと膵臓の神経島国的なネットワークの高解像度の 3 D イメージング

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological ...

High-resolution Patterning Using Two Modes of Electrohydrodynamic Jet: Drop on Demand and Near-field Electrospinning

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning tool. EHD printing uses a fluidic supplier to maintain the extruded meniscus by pushing the ink out of the nozzle tip. The electric field is then used to pull the meniscus down to the substrate to produce high-resolution patterns. Two modes of EHD printing have been used for fine patterning: continuous near-field electrospinning (NFES) and dot-based drop-on-demand (DOD) EHD printing. According to the printing modes, the requirements for the printing equipment and ink viscosity will differ. Even though two different modes can be implemented with a single EHD printer, the realization methods significantly differ in terms of ink, fluidic system, and driving voltage. Consequently, without a proper understanding of the jetting requirements and limitations, it is difficult to obtain the desired results. The purpose of this paper is to present a guideline so that inexperienced researchers can reduce the trial and error efforts to use the EHD jet for their specific research and development purposes. To demonstrate the fine-patterning implementation, we use Ag nanoparticle ink for the conductive patterning in the protocol. In addition, we also present the generalized printing guidelines that can be used for other types of ink for various fine-patterning applications.

Here, we present a protocol to produce high-resolution conductive patterns using electrohydrodynamic (EHD) jet printing. The protocol includes two modes of EHD jet printing: the continuous near-field electrospinning (NFES) and the dot-based drop-on-demand (DOD) EHD printing.

パターン化する電気流体力学的ジェットの 2 つのモードを使用して高解像度: 需要と近傍電界紡糸ドロップ

Electrohydrodynamic (EHD) jet printing has drawn attention in various fields because it can be used as a high-resolution and low-cost direct patterning ...

High-resolution Patterned Biofilm Deposition Using pDawn-Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms into arbitrary spatial patterns at high spatial resolution. The technique uses a genetically encoded optogenetic construct&#8212;pDawn-Ag43&#8212;that couples biofilm formation in E. coli to optical stimulation by blue light. We detail the process for transforming E. coli with&#160;pDawn-Ag43, preparing the required optical set-up, and the protocol for culturing patterned biofilms using pDawn-Ag43 bacteria. Using this protocol, biofilms with a spatial resolution below 25 &#956;m can be patterned on various surfaces and environments, including enclosed chambers, without requiring microfabrication, clean-room facilities, or surface pretreatment. The technique is convenient and appropriate for use in applications that investigate the effect of biofilm structure, providing tunable control over biofilm patterning. More broadly, it also has potential applications in biomaterials, education, and bio-art.

We demonstrate a method for depositing Escherichia coli bacterial biofilms in arbitrary spatial patterns with a high resolution using optical stimulation of a genetically encoded surface-adhesion construct.

高解像度使用してバイオ フィルム成膜のパターンの pDawn Ag43

Spatial structure and patterning play an important role in bacterial biofilms. Here we demonstrate an accessible method for culturing E. coli biofilms ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the effect of applied extracellular tensile strain on cell populations in vitro via biochemical assays, a device has previously been designed which can be fabricated simply and is small enough to fit inside tissue culture incubators, as well as on top of microscope stages. However, the previous design of the polydimethylsiloxane substratum did not allow high-resolution subcellular imaging via oil-immersion objectives. This work describes a redesigned geometry of the polydimethylsiloxane substratum and a customized imaging setup that together can facilitate high-resolution subcellular imaging of live cells while under applied strain. This substratum can be used with the same, earlier designed device and, hence, has the same advantages as listed above, in addition to allowing high-resolution optical imaging. The design of the polydimethylsiloxane substratum can be improved by incorporating a grid which will facilitate tracking the same cell before and after the application of strain. Representative results demonstrate high-resolution time-lapse imaging of fluorescently labeled nuclei within strained cells captured using the method described here. These nuclear dynamics data give insights into the mechanism by which applied tensile strain promotes differentiation of oligodendrocyte progenitor cells.&#160;

Using a previously designed device to apply mechanical strain to adherent cells, this paper describes a redesigned substratum geometry and a customized apparatus for high-resolution single-cell imaging of strained cells with a 100x oil immersion objective.

一軸引張ひずみ下での生細胞における核動態の高分解能イメージング

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...