この作品は、ツァンにHukriede、NCI / NIH（P01 CA78039）フォークトに、とNHLBI / NIH（1R01HL088016）にNICHD / NIH（1R01HD053287）によって運営されている。

1）ゼブラフィッシュの交配とBCIの治療を設定します。 <ol><li>個別に交配タンク1内にPT6ゼブラフィッシュと場所：2日前治療に、ホモ接合体の雄Tgを（d2eGFP dusp6）識別する。セパレータと野生型AB *メスの魚を追加し、一晩交配ケージに残す。 </li><li>翌朝には、区切り文字を削除し、そして1時間後に胚を収集する。 E3（5 mMのNaCl、0.17 mMの塩化カリウム、0.33 mMの塩化カルシウム、0.33 mMの硫酸マグネシウム）、6時間28℃で溶液とインキュベートして100ミリメートル皿に胚を移す。死んで削除し、胚を不受精の、新鮮なE3のソリューションを追加し、そして一晩インキュベートする。 </li><li>同じようなステージ（24hpf）と均一なGFPの発現のためのトランスジェニック胚を並べ替えます。 96ウェルプレートの各ウェルに個別に配列の胚。 </li><li>マイクロピペットによる過剰E3ソリューションを削除します。各ウェルにマルチチャンネルピペッターを持つE3ソリューションの200μlの追加。 </li><li>として記載されている以下の化合物を追加します。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 7 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 11 </td><td> 12 </td></tr><tr ><td> A </td><td> 2μlの DMSO </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの DMSO </td></tr><tr ><td> B </td><td> 2μlの DMSO </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの DMSO </td></tr><tr ><td> C </td><td> 2μlの DMSO </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの DMSO </td></tr><tr ><td> D </td><td> 2μlの DMSO </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの DMSO </td></tr><tr ><td> E </td><td> 2μlの DMSO </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの DMSO </td></tr><tr ><td> F </td><td> 2μlの DMSO </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの DMSO </td></tr><tr ><td> G </td><td> 2μlの DMSO </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5メートルM） </td><td> 2μlの DMSO </td></tr><tr ><td> H </td><td> 2μlの DMSO </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの BCL （0.1mm単位） </td><td> 2μlの BCL （0.5） </td><td> 2μlの BCL （1mm）の</td><td> 2μlの BCL （2mm以上） </td><td> 2μlの BCL （2.5MM） </td><td> 2μlの DMSO </td></tr></tbody></table>最終濃度は1％DMSOで1μM、5μM、10μM、20μM、25μmのBCIです。アルミ箔でプレートをカバーし、28で6時間インキュベート℃を</li></ol> 96ウェルプレートおよび分析の2）自動化イメージング。 <ol><li> 30hpf胚を麻酔するために各ウェルにtricaine（0.61mM）の10μlを追加します。 </li><li>分子デバイスImagexpressウルトラにプレートをロードする。 </li><li> Metaxpressソフトウェアを開きます。 4xの客観的かつ最大のピンホールの直径を持つ構成を選択し、レーザーオートフォーカスは、プレートの底部を検出し、関心領域を検出するために最適なZ -平面を決定するために設定する。 525分の488 nmの（GFP）の励起/発光波長での画像を取得する。ないビニングと2000x2000ピクセル（4 × 4 mm）の単一のサイトとして領域をスキャン設定する。レーザーパワーを設定し、ポジティブコントロールイメージのように明るい領域が飽和していない得る。いくつかのポジティブおよびネガティブコントロールのウェル内の適切な画像の取得を確認してください。 </li><li>プレートのスキャンを開始します。測定器は自動的にすべてのウェルとアーカイブするSQL Serverデータベース内から画像を取得します。 </li><li> Cellengerアプリケーションモジュールと分子デバイスImagexpressウルトラプラットフォームで生成される画像形式とファイル構造を認識するインポートフィルタを使用して定義するものの開発者向けに画像をアップロードする。 </li><li>カスタム設計された認知ネットワーク技術のアルゴリズム（これもルールセットと呼ばれる）を持つプロセスの画像。我々のカスタムは、最近発表されたルールセット2に基づいて開発されたアルゴリズムは、自動的に胚、卵黄、そして頭を識別するために設計されており、GFP発現ヘッド構造の明るさと面積を定量化する。 （例えば、フォーカス画像の高い化合物の毒性または外付）は胚が検出されているか、ヘッドを明確に割り当てることができない場所ウェルは分析から除外されます。いくつかのネガティブコントロールイメージ（ビヒクル処理）と陽性対照の画像（BCI処理）頭と卵黄が正しく両方で識別されるように使用するアルゴリズムを設定します。明るいヘッド構造の検出は目視観察と一致するまでの平均卵黄の強度の倍数として&quot;頭の構造が&quot;検出のしきい値を設定します。エクスポートするパラメータを定義します。この例では、最も有益なパラメータは以下、&quot;総頭の構造の輝度&quot;（図1）と呼ばれるヘッド内でGFP -陽性領域の全積分明るさだった。 <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig2.jpg" alt="図1" /> 図1 グラフは、トランスジェニック胚におけるGFPの発現にBCIの用量依存性の影響をdepicitng。 </li><li>統合されたジョブスケジューラを使用して、すべてのプレートの画像上でアルゴリズムを実行します。定義するもののソフトウェアは、複数の画像の同時分析を可能にする、複数のプロセッサ（&quot;エンジン&quot;）で分散コンピューティングを使用しています。アルゴリズムでは、応用解析と処理された画像のコピーと一緒にデータベースに保存されている画像解析、、の結果に基づいて数値の措置を計算します。 </li></ol>代表的な結果： すべての画像が分析された後、データはCellenger内で可視化することや、さらに詳しい分析やグラフ表示のためのサードパーティソフトウェア（エクセル、グラフパッドプリズム）にエクスポートできます。図2は、治療を受けた車両からのスキャン画像をアーカイブし、適用されたとCNTの分析せずに、よくBCI -扱わ。図1文書TgのGFPレポーター遺伝子の発現（dusp6：d2EGFP）でBCIの用量依存効果PT6胚。半最大応答（EC50）を引き出すために必要な濃度は約12μmであった。 <img src="/files/ftp_upload/1900/1900fig1.jpg" alt="図2" /> 図2 トランスジェニックゼブラフィッシュの胚の自動化されたイメージのキャプチャと分析。 30hpfでPT6胚：（A）DMSOの車両は、Tg（d2eGFP dusp6）を扱う。 （B）20μMBCIショーで治療したトランスジェニック胚では、GFPの発現で増加する。頭の中でGFPの発現を検出するルールセット定義するものを実行した後から胚（）の（C）画像。オレンジ色の斑点は、ソフトウェアがGFPの強度を測定する場所表す。頭の中でGFPの発現を検出するルールセット定義するものを実行した後（B）からの胚の（D）イメージ。オレンジ色の斑点は、ソフトウェアがGFPの強度を測定する場所表す。ルールセットが処理された胚にGFPの発現の拡張された領域を見つけることができたことに注意してください。

<ol>
	<li>Molina, G. A., Watkins, S. C., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens.">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Dev Biol. 7, 62-62 (2007).</li><li>Vogt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos.">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Dev Dyn. 238, 656-663 (2009).</li><li>Molina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages.">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat Chem Biol. 5, 680-687 (2009).</li></ol>

ゼブラフィッシュの化学物質の画面のスループットを制限する主な要因は、体系的にプロセスのイメージングと解析のための96ウェルプレートへの方法論の欠如です。多細胞生物の画像は、複雑な低コントラスト、そして自然の中で異質なので、既存の画像解析アルゴリズムは、生体内の特定の構造を検出し、定量化に失敗する。ほとんど公開されてゼブラフィッシュの化学物質の画面では、そのための手順全体に専用の担当者による個々のウェルの目視検査を含む。これは通常、数値リードアウトの生成と画面イメージとデータのアーカイブを完全に防ぐことができます。また、マニュアルの評価、すなわちイメージベースのスクリーニング、、スクリーンの性能のレトロスペクティブ分析を実施するためのスクリーニングキャンペーン（例えば、毒性または発達障害）の主な焦点ではなかった表現型の変化を調べ、交差する機能のいくつかの重要な利点を排除同じ化合物ライブラリーを使用して過去や未来の画面で参照スクリーニングデータ。 本報告書では、ユーザーの介入なしに、マルチウェルプレート内のゼブラフィッシュ胚の自動化されたイメージングと解析のための方法論を強調する。我々のイメージTG（dusp6：d2EGFP）に焦点リーダー（Molecular Devices社、カリフォルニア州サニーベール）のスキャンImageXpressウルトラレーザーで自動化された画像キャプチャ96ウェルプレートでPT6胚と定義するもの&quot;認知ネットワーク技術定量化することGFPに基づいた画像解析アルゴリズムを開発トランスジェニック胚の頭部で発現。方法は、段階的応答を達成し、小分子FGFシグナル伝達の活性化因子のin vivo活性の定量化。同様の結果がそれは市販のプレートリーダー2の様々なゼブラフィッシュ胚の自動化された画像キャプチャを実現することが可能であることを文書化する落射蛍光ベースのArrayScan II（セロミクス社、ピッツバーグPA）が得られた。自動的に多細胞生物の画像を分析する方法論の開発は、人間の観察によって、視覚スコアリングの必要性を排除し、将来のスクリーン付きレトロスペクティブ分析と比較のための数値データと画像の生成とアーカイブを有効にする。

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Tricaine (MS222)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Cat.# A-5040</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

我々は、ゼブラフィッシュの胚ではFGF / RAS / MAPK経路を調節できる小さな分子を識別するためのイメージベースのハイコンテンツスクリーニング（HCS）方法論の適用を示しています。ゼブラフィッシュの胚は、生体内の高含有量化学物質の画面で最適なシステムです。 1日齢の胚は、直径1mm程度であり、簡単に96ウェルプレート、ハイスループットスクリーニングのための標準形式に配列することができます。開発の最初の日の間に、胚は、このように、胚発生時の組織形成の可視化を可能にする、現在の主要な臓器のほとんどが透明です。ゼブラフィッシュの化学画面の完全な自動化は、特に自動化されたイメージの取得と分析の開発では、しかしながら、依然として課題です。我々は以前にFGF活性の制御下に緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するトランスジェニックレポーターのラインを生成し、化学物質の画面でその有用性を実証<sup&gt; 1</sup&gt;。ハイスループット生物全体のスクリーンのための方法論を確立するために、我々は、96ウェルプレートで24〜48時間の後の受精（HPF）でゼブラフィッシュ胚の自動化された画像と解析のためのシステムを開発<sup&gt; 2</sup&gt;。このビデオでは、24hpfでマルチウェルプレートにトランスジェニック胚をアレーする際の手順を強調表示し、FGFシグナリングをhyperactivates小分子（BCI）の追加<sup&gt; 3</sup&gt;。プレートは、モレキュラーデバイスImageXpressウルトラレーザースキャニング共焦点HCSリーダー上で自動化されたイメージングする前に幼虫を麻酔tricaineを加えて6時間インキュベートする。画像は、我々はトランスジェニック胚の頭部にGFPの発現を検出し、定量化するために開発された認知ネットワーク技術のアルゴリズムを使用して定義するものの開発者のソフトウェアによって処理されます。この例では、治療胚におけるGFPレポーター遺伝子の発現にBCIの用量依存的効果を測定するためにアルゴリズムの能力を強調。

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Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

我々は、マルチウェルプレートのゼブラフィッシュ遺伝子導入胚の自動化された画像と解析のためのシステムの開発について報告する。これは、線維芽細胞成長因子のレポーター遺伝子の発現に低分子化合物、BCI、の用量依存性の効果を測定し、高スループットのゼブラフィッシュの化学物質の画面を確立するための技術を提供する能力を示しています。

ゼブラフィッシュの化学スクリーンのための自動化された画像と解析の開発。

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK ...

development-automated-imaging-analysis-for-zebrafish-chemical

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K ビュー.  University of Pittsburgh Drug Discovery Institute. 我々は、マルチウェルプレートのゼブラフィッシュ遺伝子導入胚の自動化された画像と解析のためのシステムの開発について報告する。これは、線維芽細胞成長因子のレポーター遺伝子の発現に低分子化合物、BCI、の用量依存性の効果を測定し、高スループットのゼブラフィッシュの化学物質の画面を確立するための技術を提供する能力を示しています?...

ビデオ: Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

神経毒性の高いコンテンツ分析のための神経とアストロサイト共培養アッセイ

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

生物学

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

スモールハーツの半自動光ビート解析

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

キメラゼブラフィッシュ胚における網膜と脳の開発のライブイメージングのためのGFP発現割球の移植

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Imaging Glycans in Zebrafish Embryos by Metabolic Labeling and Bioorthogonal Click Chemistry

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or alkyne-tagged monosaccharides1, 2. The modified monosaccharides, processed by the glycan biosynthetic machinery, are incorporated into cell surface glycoconjugates. The bioorthogonal azide or alkyne tags then allow covalent conjugation with fluorescent probes for visualization, or with affinity probes for enrichment and glycoproteomic analysis. This protocol describes the procedures typically used for noninvasive imaging of fucosylated glycans in zebrafish embryos, including: 1) microinjection of one-cell stage embryos with GDP-5-alkynylfucose (GDP-FucAl), 2) labeling fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos with azide-conjugated fluorophores via biocompatible Cu(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), and 3) imaging by confocal microscopy3. The method described here can be readily extended to visualize other classes of glycans, e.g. glycans containing sialic acid4 and N-acetylgalactosamine5, 6, in developing zebrafish and in other living organisms.

A click-chemistry based method that allows for the rapid, noninvasive, and robust labeling of alkyne-tagged glycans in zebrafish embryos is described. Fucosylated glycans in the enveloping layer of zebrafish embryos in the late gastrulation stage were imaged in this study.

代謝標識とBioorthogonalクリックケミストリーによるゼブラフィッシュ胚でのイメージンググリカン

Imaging glycans in vivo has recently been enabled using a bioorthogonal chemical reporter strategy by treating cells or organisms with azide- or ...

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

の定量と自動ハイスループットゲノムワイドRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

ゼブラフィッシュの開発時Photoconvertibleタンパク質を用いた細胞トラッキング

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

ゼブラフィッシュ胚における組織特異的蛍光の半自動イメージング

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

自動化された蛍光寿命イメージング顕微鏡を利用してオープンソースのハイコンテンツな解析

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

ゼブラフィッシュ ランゲルハンス島における単一セルの解像度カルシウム イメージングを用いた β-細胞機能の解析

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Automated Detection and Analysis of Exocytosis

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic events in cell culture. To perform an unbiased, efficient identification and analysis of such events, a computer-vision based approach was developed and implemented in MATLAB. The analysis pipeline consists of a cell segmentation and exocytic-event identification algorithm. The computer-vision approach includes tools for investigating multiple parameters of single events, including the half-life of fluorescence decay and peak &#916;F/F, as well as whole-cell analysis of the frequency of exocytosis. These and other parameters of fusion are used in a classification approach to distinguish distinct fusion modes. Here a newly built GUI performs the analysis pipeline from start to finish. Further adaptation of Ripley&#39;s K function in R Studio is used to distinguish between clustered, dispersed, or random occurrence of fusion events in both space and time.

We developed automated computer vision software to detect exocytic events marked by pH-sensitive fluorescent probes. Here, we demonstrate the use of a graphical user interface and RStudio to detect fusion events, analyze and display spatiotemporal parameters of fusion, and classify events into distinct fusion modes.

エキソサイトーシスの自動検出と解析

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic ...