<p class="jove_content">この仕事のための資金の一部は、NSF - CAREER 0744556（ラオ）とVCU - HHMI科学教育研究プログラム（パスク）を通じて、奨学金によって提供されていました。 </p>

<p class="jove_title">パート1：サスペンション免疫細胞化学染色</p><ol><li>細胞は、単一の細胞懸濁液に収穫される。 </li><li>次に、細胞を1.5 - 2mLのマイクロチューブに移し、4分間200グラムで遠心分離されています。 </li><li> （のMg <sup>2</sup>なし<sup>+</sup>及びCa <sup>2 +）</sup>とし、4分間、200グラムで、再び遠心分離-細胞は、PBS 1mLのに再懸濁し、上清を吸引することによって洗浄される。これを2回行う必要があります。 </li><li>洗浄後、細胞を10分間室温で4％パラホルムアルデヒド（PFA）の1mLのにそれらを再懸濁させることによって固定されています。 </li><li>細胞をPBS液1mLを再度2回洗浄されている - 。 </li><li>洗浄後、ブロック液の1mLの（6％serum/94％PBS - ）でそれらを再懸濁することによりブロックの細胞。 45分間室温でこれらをインキュベートする。 </li><li>後、4分間200グラムでチューブを遠心し、ブロックのソリューションを吸引除去する。一次抗体溶液（推奨希釈率でブロックソリューションで作られた）の1mlの細胞を再懸濁する。細胞は、どちらか1時間または4℃で一晩、次の手順に進む前に、室温でインキュベートすることができます。 </li><li>次に、細胞をブロックソリューション液1mLで2回洗浄する。 </li><li>後、二次抗体溶液の1mlの再サスペンド細胞（推奨希釈度でブロックソリューションで作られた）と1時間室温でインキュベートする。 </li><li> 1時間後、細胞はその後、ブロックのソリューション液1mLを再度2回洗浄する必要があります。 </li><li>ブロックソリューションで洗浄後、PBS液1mLで再び細胞を洗浄 - 。 </li><li>様々な洗浄後、1mLの中で細胞を再懸DAPI核染色（PBS中のDAPIの1:10,000希釈 - ）と室温で5分間インキュベートする。 </li><li> 5分後、4分間200グラムでチューブを遠心する。 - PBS液1mLにDAPI核染色液と再サスペンド細胞を吸引除去する。 </li></ol><p class="jove_title">パート2：サイトスピン装置によって生成されたスライドのhPSCsの取り込み</p><ol><li>プラスチック製のスライドは、ドリルを押すだけで、それらの穴の望ましい量を加えることによって調製される。直径は、ほとんどの1ミリメートルで使用するマイクロピペット先端（s）の広い直径よりも大きくする必要があります。 </li><li>ろ紙は、ハサミでプラスチック製のスライドのパラメータにカットされます。 </li><li>セキュリティホールは、濾紙で作られています。穴の大きさ（s）はマイクロピペットの先端（s）はそれを介してぴったり収まるように十分な大きさでなければなりません。 </li><li>後は、準備プラスチックのスライドの一つは、上部とカットフィルター紙の下部（図1）に配置されたのスライドガラス上に配置されます。層は、テープで固定されています。 </li><li>パート1から汚された細胞懸濁液の100μLの最大は、（希望する単層の密度に応じて）その後、マイクロピペット先端（s）の上部に配置されます。 </li><li>必要に応じて、細胞溶液を持つ装置を秤量し、同じような重量のカウンターバランスを作成することができます。 </li><li>サイトスピン装置とカウンターバランスは、デスクトップ遠心分離機に入れ、4分間、200グラムで遠心分離されることができる。 </li><li>遠心分離後、サイトスピン装置を慎重にスライドガラスから細胞を取り除きますdoesntのように逆アセンブルされます。 </li><li>必要に応じて、過剰な周囲のPBS - ガラス側には出吸引。 </li><li>次いで、細胞を、目的の細胞単層が達成されたかどうかを確認するために蛍光顕微鏡を使用して表示することができます。 </li></ol><p class="jove_title">パート3：取付スライド</p><ol><li>希望されている実装メディアの低下は細胞を含む各地域の中心部に配置されます。 </li><li>後、カバースリップを静かに、可能であれば、気泡を回避しようとスライド上に低下する。 </li><li>過剰マウントメディアは、スライドから削除されます。 </li><li>後は、カバーガラスの側面は、マニキュアで密封されています。 </li><li>結果が観察され、文書化されるまでスライドは暗い記憶領域に保つことができます。 </li></ol>

<ol>
	<li>Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+markers+in+human+embryonic+stem+cells.">Cell surface markers in human embryonic stem cells.</a> <em style='font-style: italic'>Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays</em>. <b>407</b>, 51-61 (2007).</li><li>Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homemade+cytospin+apparatus.">A homemade cytospin apparatus.</a> <em style='font-style: italic'>Anal. Biochem</em>. <b>359</b>, 283-284 (2006).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

<p class="jove_content">私たちの研究室の目的のためには、マウス胚性繊維芽細胞（MEF）上に成長させた幹細胞培養の35mmディッシュは、サイトスピン装置で使用するための免疫細胞化学染色の手続きのために割り当てられます。その後、細胞を単一細胞懸濁液に、可能な限りMEF層のを除去する、継代酵素によって収集されます。 MEFの層から、より効果的な幹細胞の分離が必要な場合は、コロニーを手動で懸濁液に?...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Lab Tek Permanox Chamber Slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>117437</td>
<td>Material for re-used plastic slides</td>
</tr>
<tr>
<td>Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-550-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1-10&mu;L Filter Tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>1121-3810</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope Cover Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>120542-B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytoseal 280</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Richard-Allan Scientific</td>
<td>8311-4</td>
<td>Mounting Medium</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Goat Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10000C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore/Chemicon</td>
<td>MAB4304</td>
<td>Primary Antibody for SSEA-4 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore/Chemicon</td>
<td>MAB4303</td>
<td>Primary Antibody for SSEA-3 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/ Molecular Probes</td>
<td>A11029</td>
<td>Secondary Antibody for SSEA-4 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/ Molecular Probes</td>
<td>A11006</td>
<td>Secondary Antibody for SSEA-3 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI, Dihydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CalBioChem</td>
<td>268298</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

immunocytochemical analysis of human pluripotent stem cells using a self-made cytospin apparatus

<p class="jove_content">ヒト胚性幹細胞（ヒトES）とヒトの人工多能性幹細胞（hiPSCs）を含むヒト多能性幹細胞（hPSCsは）彼らの無限の自己複製機能と、複数の細胞型に分化する潜在能力に起因する刺激的な細胞源です。 hPSCsの多能性状態は、典型的には、定量PCR、免疫細胞化学などの手法によって評価され、その他で<em&gt; in vitroで</em&gt;と<em&gt; in vivoで</em複数の細胞型へ&gt;差別化戦略。これらの中でも、免疫細胞化学的手法は、候補細胞内および細胞表面マーカーの分析に基づいてhPSCsの未分化状態の日常的特性評価のために開発されている。 hPSCsがコロニーとして成長しているという事実を考えると、問題は定期的に個々の細胞レベルでこれらのマーカーの発現を定量化するに生じる。フローサイトメトリー分析は、この問題に対処するが、細胞数を必要とし、通常はhPSC文化の日常的な品質管理の評価のための助長ではない試薬を使用するのに役立つ。このように、マーカーの評価のために保存整合性と単層の細胞サンプルの作成の実践的かつ再現可能な手段の開発は、幹細胞研究の多くの利点があります。単分子層からの個々の細胞が容易に特定のマーカーの発現について観察し、定量化できるため、これは大幅に免疫細胞化学的分析に利益をもたらします。この目標に向けて、自作サイトスピン装置が建設され、免疫細胞化学染色の使用に最適化。二つの細胞表面マーカー（SSEA3/SSEA4）式は、このプロトコルの目的のためにバリアントBG01の幹細胞株で分析した。</p>

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Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

<p class="jove_content">細胞表面マーカー（SSEA-3/SSEA-4）のためのヒト多能性幹細胞（hPSCs）の懸濁液を免疫細胞化学染色を観察し、定量化のための細胞の単層を作成するために自作サイトスピン装置の使用に基づいて達成された。</p>

セルフメイドサイトスピン装置を用いてヒト多能性幹細胞の免疫細胞化学的解析

Human pluripotent stem cells (hPSCs) that include human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are exciting cell ...

immunocytochemical-analysis-human-pluripotent-stem-cells-using-self

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K ビュー.  Virginia Commonwealth University. 細胞表面マーカー（SSEA-3/SSEA-4）のためのヒト多能性幹細胞（hPSCs）の懸濁液を免疫細胞化学染色を観察し、定量化のための細胞の単層を作成するために自作サイトスピン装置の使用に基づいて達成された。