<p class="jove_content"> Financiamento parcial para este trabalho foi fornecida pela NSF CARREIRA-0744556 (Rao) e uma bolsa de estudos através do VCU-HHMI Ciências da Educação e Programa de Pesquisa (Pascual). </p>

<p class="jove_title"> Parte 1: Coloração Suspensão imunocitoquímico </p><ol><li> As células são colhidas em uma suspensão de células individuais. </li><li> As células são então transferidos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 2mL e centrifugado a 200g por 4 minutos. </li><li> As células são lavadas por aspiração fora sobrenadante, re-suspensas em 1mL de PBS - (sem Mg <sup>2 +</sup> e Ca <sup>2 +)</sup> e depois centrifugada novamente a 200g por 4 minutos. Isto deve ser feito duas vezes. </li><li> Após a lavagem, as células são então fixado pelo re-suspendendo-as em 1mL de 4% paraformaldeído (PFA) em temperatura ambiente por 10 minutos. </li><li> As células são lavadas novamente duas vezes com 1mL de PBS -. </li><li> Depois de células de lavar roupa, bloco por re-suspendendo-as em 1 ml de solução de bloco (6% serum/94% PBS -). Incubar esses em temperatura ambiente por 45 minutos. </li><li> Após, centrifugar tubos de 200g por 4 minutos e aspirar a Solução Block. Re-suspender as células em 1mL da solução de anticorpo primário (feito com solução de Bloco na diluição recomendada). As células podem ser incubadas em temperatura ambiente por 1 hora ou a 4 ° C durante a noite antes de prosseguir para a próxima etapa. </li><li> Células são então lavadas duas vezes com 1 ml de solução Block. </li><li> Depois, volte a suspender as células em 1mL de solução de anticorpo secundário (feito com solução de Bloco na diluição recomendada) e incubar à temperatura ambiente por 1 hora. </li><li> Depois de uma hora, as células devem ser lavadas novamente duas vezes com 1 ml de solução Block. </li><li> Após a lavagem com solução de Bloco, lave as células novamente com 1mL de PBS -. </li><li> Após as lavagens diversas, re-suspender as células em 1mL de DAPI nuclear mancha (diluição de 1:10.000 em PBS DAPI -) e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. </li><li> Após 5 minutos, centrifugar tubos de 200g por 4 minutos. Aspirar a solução nuclear DAPI mancha e re-suspender as células em 1mL de PBS -. </li></ol><p class="jove_title"> Parte 2: Incorporação de hPSCs em slides gerados por aparelhos cytospin </p><ol><li> Slides de plástico são preparados por fazer a quantidade desejada de furos com uma broca imprensa. O diâmetro deve ser no máximo um milímetro maior que o maior diâmetro da ponta da micropipeta (s) a ser utilizado. </li><li> Filtro de papel é cortado com os parâmetros da lâmina de plástico com uma tesoura. </li><li> Furos são feitos então no papel de filtro. O tamanho do buraco (s) deve ser grande o suficiente para que a ponta micropipeta (s) se encaixa confortavelmente através dele. </li><li> Depois, um dos slides de plástico preparado é colocado na parte superior e uma lâmina de vidro na colocados na parte inferior do papel filtro de corte (Figura 1). As camadas são fixados com fita adesiva. </li><li> Um máximo de 100μL (dependendo da densidade desejada monocamada) da suspensão de células coradas da Parte 1 é então colocado no topo da ponta da micropipeta (s). </li><li> Se necessário, o aparelho com a solução de célula pode ser pesado e um contrapeso de peso semelhante criado. </li><li> O aparelho cytospin e contrapeso pode são então colocados em uma centrífuga de mesa e centrifugado a 200g por 4 minutos. </li><li> Após a centrifugação, o aparelho é cuidadosamente desmontado cytospin de uma forma que doesnt desalojar as células da lâmina de vidro. </li><li> Se necessário, o excesso de PBS redor - do lado de vidro em aspirados para fora. </li><li> As células podem ser visualizados usando um microscópio de fluorescência para verificar se a monocamada de células desejado foi alcançado. </li></ol><p class="jove_title"> Parte 3: slides de montagem </p><ol><li> A queda dos meios de comunicação de montagem desejada é colocado diretamente no centro de cada área contendo células. </li><li> Depois, a lamínula é suavemente baixou para os slides tentando evitar as bolhas de ar, se possível. </li><li> Excesso de meios de montagem é então removido do slides. </li><li> Depois, os lados do lamínulas são selados com verniz. </li><li> Os slides podem ser mantidos em uma área de armazenamento escuro até que os resultados são observados e documentados. </li></ol>

<ol>
	<li>Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+markers+in+human+embryonic+stem+cells.">Cell surface markers in human embryonic stem cells.</a> <em style='font-style: italic'>Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays</em>. <b>407</b>, 51-61 (2007).</li><li>Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homemade+cytospin+apparatus.">A homemade cytospin apparatus.</a> <em style='font-style: italic'>Anal. Biochem</em>. <b>359</b>, 283-284 (2006).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

<p class="jove_content"> Para efeitos do nosso laboratório, um prato de 35 milímetros de culturas de células-tronco cultivadas em fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) é alocado para o procedimento de coloração imunocitoquímica para uso com o aparelho cytospin. As células são então coletados por meio de passaging enzimática, removendo o máximo da camada de MEF quanto possível, em uma suspensão de uma única célula. Se mais de isolamento de células-tronco eficaz a partir da camada MEF é desejada, as colônias podem ser manua...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Lab Tek Permanox Chamber Slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>117437</td>
<td>Material for re-used plastic slides</td>
</tr>
<tr>
<td>Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-550-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1-10&mu;L Filter Tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>1121-3810</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope Cover Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>120542-B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytoseal 280</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Richard-Allan Scientific</td>
<td>8311-4</td>
<td>Mounting Medium</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Goat Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10000C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore/Chemicon</td>
<td>MAB4304</td>
<td>Primary Antibody for SSEA-4 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore/Chemicon</td>
<td>MAB4303</td>
<td>Primary Antibody for SSEA-3 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/ Molecular Probes</td>
<td>A11029</td>
<td>Secondary Antibody for SSEA-4 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/ Molecular Probes</td>
<td>A11006</td>
<td>Secondary Antibody for SSEA-3 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI, Dihydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CalBioChem</td>
<td>268298</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

immunocytochemical analysis of human pluripotent stem cells using a self-made cytospin apparatus

<p class="jove_content">Células pluripotentes estaminais humanas (hPSCs) que incluem células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs) são fontes de células emocionante devido à sua ilimitada capacidade de auto-renovação e seu potencial de se diferenciar em vários tipos de células. O estado de pluripotentes hPSCs é tipicamente avaliada por técnicas tais como qPCR, imunocitoquímica, e por outros<em&gt; In vitro</em&gt; E<em&gt; In vivo</em&gt; Estratégias de diferenciação em vários tipos de células. Entre estas, as técnicas de imunocitoquímica têm sido desenvolvidos para a caracterização de rotina do estado indiferenciado de hPSCs com base na análise de biomarcadores candidato intracelulares e de superfície celular. Dado o fato de que hPSCs crescer como colônias, os problemas surgem em quantificar a expressão destes marcadores no nível da célula individual em uma base rotineira. Análises de citometria de fluxo serve para resolver este problema, mas requerem números de celular e uso de reagentes que normalmente não são propícias para a avaliação de rotina de controle de qualidade das culturas hPSC. Assim, o desenvolvimento de meios práticos e reprodutíveis de criação de amostras de células em monocamada com integridade preservada para avaliação marcador tem muitas vantagens nas pesquisas com células-tronco. Este beneficia muito a análise imunocitoquímica porque as células individuais da monocamada podem ser facilmente observados e quantificados para a expressão de marcadores específicos. Para atingir este objetivo, um self-made cytospin aparelho foi construído e otimizado para uso com coloração imuno-histoquímico. Dois marcadores de superfície celular (SSEA3/SSEA4) expressão foram analisados ​​em uma variante da linha de células-tronco BG01 para o objectivo deste protocolo.</p>

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Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

<p class="jove_content">Suspensão coloração imunocitoquímica de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para marcadores da superfície celular (SSEA-3/SSEA-4) foi alcançada com base na utilização de um aparelho cytospin self-made para criar uma monocamada de células para observação e quantificação.</p>

Análise imunocitoquímica de células-tronco humanas pluripotentes usando um Self-Made Aparelho Cytospin

Human pluripotent stem cells (hPSCs) that include human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are exciting cell ...

immunocytochemical-analysis-human-pluripotent-stem-cells-using-self

Research

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Biology

14.2K visualizações.  Virginia Commonwealth University. Suspensão coloração imunocitoquímica de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para marcadores da superfície celular (SSEA-3/SSEA-4) foi alcançada com base na utilização de um aparelho cytospin self-made para criar uma monocamada de células para observação e quantificação.