<p class="jove_content"> NSF KARİYER 0744556 (Rao) ve VCU HHMI Bilim Eğitim ve Araştırma Programı (Pascual) aracılığıyla burs tarafından bu iş için kısmi finansman sağlandı. </p>

<p class="jove_title"> Bölüm 1: Süspansiyon İmmünositokimyasal Boyama </p><ol><li> Hücreler tek bir hücre süspansiyonu hasat edilir. </li><li> Bu hücreler daha sonra 1.5 2mL mikrosantrifüj tüpler aktarılır ve 200g 4 dakika santrifüj. </li><li> Hücreler supernatant dışarı aspire tarafından yıkanır, PBS 1mL yeniden askıya - (Mg <sup>2</sup> olmadan <sup>+</sup> ve Ca <sup>2 +)</sup> ve sonra 4 dakika için 200 gr tekrar santrifüj. Bu iki kez yapılmalıdır. </li><li> Yıkadıktan sonra, hücreler daha sonra yeniden askıya onlara 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 1 ml% 4 paraformaldehid (PFA) tarafından sabitlenir. </li><li> Hücreler iki kez 1ml PBS tekrar yıkanır. </li><li> Yıkama, blok hücreleri sonra yeniden askıya Blok Çözüm 1 ml (% 6 serum/94% PBS). 45 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 200 gr az 4 dakika sonra, tüpler santrifüj ve Blok Çözüm aspirat. Primer antikor çözeltisi (Blok Çözüm tavsiye seyreltme ile yapılan) 1ml hücreleri yeniden askıya. Hücreler ya 1 saat veya 4 ° C&#39;de bir gece bir sonraki adıma geçmeden önce oda sıcaklığında inkübe edilebilir. </li><li> Hücreler daha sonra Blok Çözüm 1mL ile iki kez yıkanır. </li><li> Sekonder antikoru çözümü (tavsiye edilen seyreltme Blok Çözüm ile yapılan) ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe 1mL hücreleri yeniden askıya sonra. </li><li> 1 saat sonra, hücreler daha sonra Blok Çözüm 1mL ile iki kez tekrar yıkanmış olmalıdır. </li><li> Blok Çözüm ile yıkadıktan sonra, 1 ml PBS ile tekrar hücreleri yıkayın. </li><li> Çeşitli yıkar sonra, 1 ml hücrelerin yeniden askıya DAPI nükleer leke (PBS içinde DAPI 1:10,000 seyreltme -) ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> 5 dakika sonra, 4 dakika için 200 gr tüpler santrifüj. - 1 ml PBS DAPI nükleer leke çözüm ve yeniden askıya hücreleri aspire. </li></ol><p class="jove_title"> HPSCs Incorporation Bölüm 2: sitospin aparatı sayesinde üretilen slaytlar </p><ol><li> Plastik slaytlar, bir matkap basın delik istenilen miktarda yaparak hazırlanıyor. Kullanılmak üzere geniş çaplı mikropipet ucu (ler) den en fazla 1 mm daha geniş çaplı olması gerekir. </li><li> Filtre kağıdı, makas ile plastik slayt parametreleri kesilir. </li><li> Delik sonra filtre kağıdı yapılır. Deliğin boyutu (ler) mikropipet ucu (ler) aracılığıyla snuggly oturduğundan emin yeterince büyük olmalıdır. </li><li> Sonra, hazırlanan plastik slaytlar bir üst ve alt kesilmiş filtre kağıdı (Şekil 1) yerleştirilmiş bir cam slayt üzerine yerleştirilir. Katmanları bant ile sabitlenir. </li><li> Bölüm 1 lekeli hücre süspansiyonu 100μL maksimum (istenilen tek tabaka yoğunluğuna bağlı olarak) daha sonra mikropipet ucu (lar) üstüne yerleştirilir. </li><li> Gerekirse, cihazı hücre çözümü ile tartılır ve benzer ağırlıkta bir karşı denge oluşturulmuş. </li><li> Sitospin aparatı ve dengelemek sonra bir masaüstü santrifüj yerleştirilir ve 200g 4 dakika santrifüj yapabilirsiniz. </li><li> Santrifüj sonra, sitospin aparat dikkatle cam slayt hücreler yerinden doesnt bir şekilde demonte. </li><li> Gerekirse, aşırı çevreleyen PBS - cam tarafında aspire. </li><li> Hücreler daha sonra istediğiniz hücreye tek tabaka elde edilip edilmediğini kontrol etmek için bir floresan mikroskop kullanılarak görülebilir. </li></ol><p class="jove_title"> Bölüm 3: Montaj slaytlar </p><ol><li> Bir damla istenen montaj medya hücreleri içeren her bölgenin merkezinde yer almaktadır. </li><li> Sonra, mümkünse hava kabarcıklarını önlemek için çalışıyoruz Slaytlarınıza bir kapak kayma yavaşça indirilir. </li><li> Aşırı montaj medya sonra slayt kaldırılır. </li><li> Sonra, kapak fişleri iki tırnak cilası ile mühürlenir. </li><li> Slaytlar sonuçları gözlemlenen ve belgelenen kadar karanlık bir depolama alanı saklanabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+markers+in+human+embryonic+stem+cells.">Cell surface markers in human embryonic stem cells.</a> <em style='font-style: italic'>Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays</em>. <b>407</b>, 51-61 (2007).</li><li>Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homemade+cytospin+apparatus.">A homemade cytospin apparatus.</a> <em style='font-style: italic'>Anal. Biochem</em>. <b>359</b>, 283-284 (2006).</li></ol>

<p class="jove_content"> Laboratuvar amaçları için, 35mm, fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) yetişen kök hücre kültürleri bir çanak immünositokimyasal boyama prosedürü için sitospin aparatı ile kullanım için ayrılmıştır. Hücreler daha sonra bir tek hücre süspansiyonu, MEF katmanı mümkün olduğu kadar çok kaldırarak, Pasajlanması enzimatik yoluyla tahsil edilir. MEF katman daha etkili kök hücre izolasyonu isteniyorsa, koloniler elle süspansiyon içine sindirilmiş sonra aldı olabilir. Besleyici ücretsiz koşul...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Lab Tek Permanox Chamber Slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>117437</td>
<td>Material for re-used plastic slides</td>
</tr>
<tr>
<td>Superfrost/Plus Microscope Slides Precleaned</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-550-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1-10&mu;L Filter Tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USA Scientific</td>
<td>1121-3810</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope Cover Glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>120542-B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytoseal 280</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Richard-Allan Scientific</td>
<td>8311-4</td>
<td>Mounting Medium</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal Goat Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10000C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse Anti-SSEA-4 Monoclonal Antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore/Chemicon</td>
<td>MAB4304</td>
<td>Primary Antibody for SSEA-4 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Rat Anti-SSEA-3 Monoclonal Antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore/Chemicon</td>
<td>MAB4303</td>
<td>Primary Antibody for SSEA-3 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/ Molecular Probes</td>
<td>A11029</td>
<td>Secondary Antibody for SSEA-4 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen/ Molecular Probes</td>
<td>A11006</td>
<td>Secondary Antibody for SSEA-3 staining</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI, Dihydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>CalBioChem</td>
<td>268298</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

immunocytochemical analysis of human pluripotent stem cells using a self-made cytospin apparatus

<p class="jove_content">Insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ve insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri (hiPSCs) İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) sınırsız kendini yenileme yetenekleri ve çok sayıda hücre tipleri ayırt etmek için potansiyel nedeniyle heyecan verici hücre kaynaklarıdır. HPSCs pluripotent devlet qPCR, immünsitokimya gibi teknikler genellikle değerlendirilen ve diğer<em&gt; In vitro</em&gt; Ve<em&gt; In vivo</em&gt; Birden çok hücre tiplerine farklılaşma stratejileri. Bunlar arasında, immünositokimyasal teknikleri aday hücre içi ve hücre yüzeyi biyobelirteçleri analizine dayalı hPSCs farklılaşmamış devletin rutin karakterizasyonu için geliştirilmiştir. Koloniler, sorunları rutin olarak tek tek hücre düzeyinde bu belirteçlerin ifade nicel olarak ortaya çıkan hPSCs büyüdüğünü göz önüne alındığında. Flow sitometri analizleri, bu sorunu ancak hücre sayıları ve normal, hPSC kültürlerin rutin kalite kontrol değerlendirmesi için elverişli değildir reaktifler kullanımı için hizmet vermektedir. Böylece, belirteç değerlendirilmesi için bütünlüğü korunmuş tek tabaka hücre örnekleri oluşturmak pratik ve tekrarlanabilir araçlarının geliştirilmesi, kök hücre araştırmaları pek çok avantajı vardır. Tek tek hücrelerin tek tabaka kolayca gözlenir ve spesifik belirteçler ifade için nicel olabilir, çünkü bu, immünositokimyasal analiz büyük ölçüde yarar sağlar. Bu hedefe doğru, self-made sitospin aparat inşa edildi ve immünositokimyasal boyama ile kullanım için optimize edilmiş. İki hücre yüzey belirteçleri (SSEA3/SSEA4) ifadesi için bir varyantı BG01 Bu protokolün amacı, kök hücre hattı analiz edildi.</p>

Watch this Scientific Journal Video about Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus at JoVE.com

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

<p class="jove_content">Gözlem ve ölçümü için bir tek tabaka hücreleri oluşturmak için bir self-made sitospin cihazların kullanımı dayalı, insan pluripotent kök hücreleri hücre yüzey belirteçleri için Süspansiyon immünositokimyasal boyama (hPSCs) (SSEA-3/SSEA-4) elde edildi.</p>

Self-Made sitospin Aparatı kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücre İmmünositokimyasal Analizi

Human pluripotent stem cells (hPSCs) that include human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are exciting cell ...

immunocytochemical-analysis-human-pluripotent-stem-cells-using-self

Research

JoVE Journal

Biology

14.2K Görüntüleme.  Virginia Commonwealth University. Gözlem ve ölçümü için bir tek tabaka hücreleri oluşturmak için bir self-made sitospin cihazların kullanımı dayalı, insan pluripotent kök hücreleri hücre yüzey belirteçleri için Süspansiyon immünositokimyasal boyama (hPSCs) (SSEA-3/SSEA-4) elde edildi.