まず、ポリテトラフルオロエチレンまたはPTFEコーティングされたスライドを、バイオセーフティキャビネット内の70%エタノールに10分間浸して滅菌します。スライドを滅菌済みの100mm細胞培養皿で風乾します。各スライドを1つの新しい100ミリメートル細胞培養皿に入れ、200マイクロリットルの血清含有細胞培養培地を各長方形に追加します。
次に、ハンドヘルドの254ナノメートルのUV光を100ミリメートルの細胞培養皿に置き、電球をスライドに直接向けて20分間置きます。外側セグメント(OS)の凍結アリコートを摂氏37度の水浴で解凍します。次に、OSを2, 400Gで室温で5分間回転させます。
直ちにピペットを使用してバイオセーフティキャビネット内の上清を吸引し、OSをPBSに再懸濁します。次に、スライドから培地を吸引し、各スライド長方形に、ミリリットルPBS溶液あたり2 x 10から8番目のOSの2 x 10からミリリットルPBS溶液あたり8番目のOSを最大500マイクロリットル配置します。ハンドヘルドの254ナノメートルのUV光を細胞培養皿の上に置き、電球をOSに直接向けて40分間置きます。
OS-PBS溶液を1.5ミリリットルのチューブに集めます。コーティングされたスライドの長方形を200〜500マイクロリットルのPBSで洗浄し、各洗浄物をマイクロ遠心チューブに集めます。次に、OS-PBS溶液を室温で5分間2, 400Gでスピンダウンします。
バイオセーフティキャビネット内のPBSをピペッターで吸引し、網膜色素上皮またはRPE培養に使用する500マイクロリットルの標準培地にペレットを再懸濁します。10マイクロリットルの懸濁液を新しいマイクロ遠心チューブに入れます。さらに細胞培養培地で50〜100倍に希釈し、血球計算盤でOSをカウントします。
光酸化OS(OxOS懸濁液)を1ミリリットルあたり5.6 x 10から7番目のOS濃度で標準RPE培地に希釈します。OSの取り込みとリポフスチンの蓄積を促進する食作用ブリッジリガンドを追加します。次に、OxOSを使い捨てストックに分注し、液体窒素で急速凍結します。
凍結したアリコートを45マイクロリットルの細胞培養培地で希釈してOxOSアリコートを解凍してから、RPEトランスウェルに添加してリポフスチン蓄積を誘導します。次に、共焦点顕微鏡でラムダスキャンを使用してOxOS発光スペクトルを測定することにより、酸化されたOSを特徴付けます。共焦点イメージングは、処理されたOSが未処理のOSと比較して自家蛍光を増加させたことを示した。
