マウスから脈管線条を解剖して免疫染色の準備をし、1X PBS中の200マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドを含む24ウェルプレートに組織を追加します。組織を室温で20分間インキュベートします。低RPMのオービタルシェーカーで1X PBSを2回短時間洗浄します。
PBSを除去し、300マイクロリットルのPBST溶液中で室温で最低1時間透過処理とブロッキングを行います。次に、一次抗体で組織を4°Cで一晩染色します。次に、二次抗体を添加し、低RPMのオービタルシェーカー上で室温で2時間インキュベートします。
プレートを覆い、蛍光タグ付きの二次抗体を光から保護します。次に、18 x 18 mmのガラスカバースリップよりも小さい25 mmの軸に沿って2本の小さな接着剤の縞を配置して、より大きなマイクロスライドを準備します。接着剤の縞の間に1滴の取り付け試薬を置きます。
55番の鉗子を使用して、SVの一端の組織をできるだけ少なくし、PBSから封入試薬に移します。接着剤の1本の縞が置かれたスライドにカバースリップの一方の端を置きます。次に、気泡が発生しないようにカバースリップをそっと放します。
マウントの各コーナーに透明なマニキュアを一滴軽くたたき、マウントを密封します。可視化フィールドから離れたガラスカバースリップに試料にラベルを付けます。SV組織を解剖顕微鏡で視覚化し、気泡の近くに平らに横たわっていないことを確認します。
SV組織の向きが正しくない場合は、気泡を押し出すか、小さいガラスカバースリップを慎重に取り外してSVの位置を変えてみてください。P30マウスからのSVの全マウントを調製し、共焦点イメージングを行った。ZsGreen発現は、中間細胞、GSIB4標識内皮細胞、およびDAPI標識核において観察された。
