単細胞RNAシーケンシングは、細胞の転写プロファイル、特に中枢神経系などの異種組織を研究するための強力なツールです。このプロトコルは、単核RNAシーケンシング用の核を単離する方法を提供する。細胞の代わりに核を用いることで、この方法は、凍結組織だけでなく、解解化が困難な組織に適用することができる。
さらに、この方法は、疾患または傷害後の細胞における細胞型特異的変化を研究するために適用することができる。テキスト プロトコルで説明されているように、マウス安楽死でこの手順を開始します。次に、体の長さに沿って切開を行い、内臓を露出させる。
鉗子を使用して体腔から内臓を引っ張ることによって、マウスを回避する。汚れが生じる可能性があるため、ペーパータオルを使用してエリアを清掃したり、臓器を取り除いたりしないでください。はさみを使用して、L2とL3脊椎間の椎骨柱を切断します。
脊髄を取り出すには、25ゲージ1/4インチの針で氷冷PBSを含む3ミリリットルの注射器を取り付けます。針の先端を脊椎柱の仙骨端に入れる。2本の指を使って椎骨をつまんで針の先端にタイトなシールを作成し、プランジャーを押して脊髄をロストリーで排出します。
氷冷PBSのペトリ皿に脊髄を入れます。コードの腰部のみが必要な場合は、脊髄の仙骨部と胸部を切り取ってください。この時点で、組織を凍結し、マイナス80°Cで保存するか、またはここで説明するように洗剤機械的細胞のリシス、またはテキストプロトコルに記載されているように低張力機械的なライシスのいずれかにすぐに使用する。
洗剤の機械的細胞のリシスを決定するには、腰椎を冷やされたDounceホモジナイザーに入れ、500マイクロリットルの冷やされた洗剤リシスバッファーを加えます。緩い害虫の5ストローク、A、そしてタイトな害虫の5〜10ストロークでダウンス、B.ストロークの間に溶解溶液の外側のホモジナイザーを持ち上げることを避け、気泡を導入することを避けてください。さて、40ミクロンのストレーナーを冷やした50ミリリットルの円錐管の上に置き、低いショ糖緩衝液の1ミリリットルで予め濡らします。
粗核を含むDounceホモジナイザーに低いショ糖バッファーを1ミリリットル加え、2~3回ピペットで軽く混ぜます。40ミクロンのストレーナーの上に粗核の準備を渡し、事前に冷やした50ミリリットルの円錐形チューブに入れられます。40ミクロンのストレーナーの上に追加の1ミリリットルの低スクロースバッファーを渡し、最終体積を低スクロースバッファーの3ミリリットルと500マイクロリットルのリシスバッファーに持ち込みます。
複数のコードを組み合わせて、同じ円錐形のチューブで冷却する場合は、これらの手順を繰り返します。次いで、試料を摂氏4度で10分間Gの3200倍に遠心する。遠心分離が完了したら、上清をデカントします。
我々は、低いショ糖バッファーの3ミリリットルを使用してパレットを中断します。壁からペレットを取り除くように静かに旋回し、再懸濁を容易にします。サンプルを氷の上に2分間置いた後、サスペンションをオークリッジチューブに移します。
1の設定でホモジナイザーを使用して、低ショ糖バッファー内の核を15〜30秒間均質化し、サンプルを氷の上に保ちます。次に、血清ピペットを使用して12.5ミリリットルの密度スクロースバッファーを層し、低ショ糖バッファーホモジネートの下に、密度層を破壊する気泡を作り出さないので注意する。チューブをGの3200倍、摂氏4度で20分間遠心分離する。
遠心分離が完了したら、すぐにフリックモーションで上清をデカントします。この手順を試みる間、直ちに遠心分離機からオークリッジチューブを取り外し、上清を素早くデカントすることを忘れないでください。100マイクロリットルから1ミリリットルの再懸濁液を用いて、壁に残っている核を懸濁させる。
洗剤ベースの準備に残っているミエリンの眉をひそめないようにしてください。これらのステップを迅速に行わないと、過剰な細胞破片、またはミエリンを含む核調製が行われ、下流の単核RNAシーケンシングを妨げる可能性があります。30〜35ミクロンの孔サイズストレーナーを介して核をフィルタリングし、事前に冷却されたチューブに収集します。
テキストプロトコルに記載されているように、単核RNAシーケンシングに進む前に、ヘモサイトメーターを使用して10 xの目的の下で核を数え、核収率を決定する。核の明るいフィールドおよび蛍光画像は、洗剤機械的なリシスプロトコルを用いて単離され、10xで示される。これらの核は、単一細胞のレベルで内因性遺伝子発現プロファイルの研究を可能にする、公平な方法で単離される。
ここに示されている、単核RNAシーケンシングの代表的なtSNEプロットは、マウス腰椎脊髄から、大規模に平行な液滴カプセル化プラットフォームを用いた。新鮮な組織または凍結組織から単離された核は、商業的および学術的なプラットフォームの両方でシーケンシングに使用することができます。この技術により、研究者は、脊髄などの解解化が困難な組織、あるいはバイオバンク材料などの凍結組織を使用して、単一細胞レベルで転写プロファイルを探索することができます。
この手順を試みる間, 安楽死と細胞のリシスの間の時間の量を減らすことが重要です..さらに、細胞のリシスから再懸濁液に導入される気泡を最小限に抑え、ペットの核を注意して購入することが重要です。この手順に従って、核は、特定の細胞タイプを分離するために、ファックソートなどの代替用途に使用することができる。
