Bleaching and Plating Caenorhabditis elegans P0 Generation Embryos onto RNAi-NGM plates

OP50-1 細菌を播種した 35 mm 標準 NGM プレートの下で 3 つまたは 4 つの Caenorhabditis elegans 成虫を選別することにより、RNAi 継承アッセイのために動物を調製します。4日後、Triton X-100を添加した800マイクロリットルのM9緩衝液を使用して、プレートから1.5ミリリットルのチューブに成虫を洗い流します。洗浄を繰り返し、ワームを1つのチューブに引き込みます。

ワームを1, 000Gで1.5〜2分間遠心分離した後、ワームペレットを乱すことなく100マイクロリットルを残して上清を吸引します。ワームペレットを含む各チューブに、650マイクロリットルの二重蒸留水を加えます。収集した集団からC.elegans胚を単離するには、新たに調製した漂白溶液250マイクロリットルを加え、タイマーを開始します。

1〜2分ごとに、チューブを完全にボルテックスします。5分後、ステレオスコープの下で成虫の劣化を監視します。ワームが完全に溶解し、胚だけが残るまでボルテックスを続けます。

通常、これには 6 分から 7 分かかります。直ちにチューブを1, 000 Gで1.5分間遠心分離し、上澄み液を吸引し、約50〜100マイクロリットルの上清を胚に残します。Triton X-100を添加したM9バッファー1ミリリットルを胚とボルテックスに加えます。

懸濁液を遠心分離し、洗浄を2回繰り返します。最終洗浄後、上清を吸引し、約100マイクロリットルをチューブ内に残します。単離された胚でチューブをボルテックスし、各チューブから2マイクロリットルをラベル付きスライドガラスに2回ピペットで移動させます。

集計カウンターを使用して胚を数え、マイクロリットルあたりの胚の濃度を推定します。半同期した個体群増殖を開始するには、約250個の胚を、GFPまたはコントロールRNAiベクターを使用して大腸菌HT115細菌を含む各RNAi NGMプレートに移植します。液体を吸収させます。

RNAiで処理したPノート世代を摂氏21度で4日間インキュベートします。