内部の制度資金とミシガン大学の生物科学の奨学金プログラムは、この作業を支持した。

ワームの準備<ol><li>前の画像22〜適切なプレート18 - 24にL4幼虫のワームを転送します。これは、初期胚の十分な供給のための卵有利子大人を持って保証されます。 </li><li>ワセリンとアガロースのチューブを準備します。我々はマイクロ波のビーカーにワセリンを溶融し、チューブ4〜5 mLずつに分注して、いくつかの15mlのファルコンチューブを準備する。同様に2〜3パーセント（w / v）のバッファーのアガロース（M9または卵バッファ）とファルコンチューブに分注し4-5 mLを溶かす。蒸発を最小限に抑えるために過剰に沸騰しないように注意してください。イメージングの日に、65〜70℃のヒートブロックにワセリンの1チューブを溶融し、電子レンジでアガロースの1チューブを溶かす、何度も沸騰最小限に抑えるように注意してください。溶融状態でワセリンやアガロースを保つためにヒートブロックにチューブを保管してください。 </li><li>アガロースパッドを作る。各ガイドのスライドの上部と底部に付着一般的な実験のテープの単層によって覆わスライドである2ガイドのスライドの間に新しい顕微鏡のスライドを、置きます。新しいスライドに溶融アガロースの2〜3滴を配置する決裂エンドでパスツールピペットを使用してください。それがカバーし、薄い正方形のパッドを作成するためにアガロースを広めるのに役立つように、元のスライドに2回目のスライドに垂直でカバー。第2のスライドは、ガイドのスライド上にテープの上にくるようにしてください。アガロースの濃度は、厚いパッドを5％に増加させることができる。 </li><li>解剖範囲と白金線を使用すると、18ミリメートル× 18 mmのカバースリップ上にM9や卵バッファの9 -12μLドロップする、転送2大人のワームを&quot;選ぶ&quot;。 </li><li>針（我々は27G1 / 2の針を使用）または胚を解放するためにメスで開いているワームをカット。ワームの途中でカットしてみてください。 </li><li>胚を含む18 × 18 mmのカバースリップの上にアガロースパッドを（下に寒天の側で）下げてください。かみそりの刃と、カバースリップの端から伸びる寒天をトリミング。 </li><li>カバースリップの四隅に溶かしたワセリンを適用するペイントブラシや細い木の棒を使用して、シールのカバースリップ。 </li></ol> （卵の殻が正常に形成しない場合など）は胚が圧力の影響を受けやすい場合ハングアップしている寒天のマウントの代わりに23をドロップします。イメージングは、受精や減数分裂のような初期のイベントに追従するように子宮内で行うことができます。ワームは、レバミゾール24と麻酔でなければなりません。開発の特定の段階から、胚の数を増やすために、いくつかのワームは、一度、ゆっくりとピペット精密チップやまつげのブラシを使って一緒に位置付け胚でまたは口のピペッティングによって解剖されることがあります。 4DノマルスキーDIC（微分干渉コントラスト）映画<ol start="8"><li>オリンパスBX61顕微鏡をオンにします。カメラはそれが最初に、最後の水銀球（GFPや蛍光ために必要に応じて）オンになっている他の機器から放出される電磁波に敏感ですので。すべてが上になるとマイクロマネージャを起動します。 DICまたは蛍光イメージングのための適切な設定ファイルを選択してください。大きな違いは、DICファイルは、蛍光シャッターの制御が含まれていないことです。各ファイルには、適切なフィルタキューブとカメラのゲイン設定を選択します。 </li><li> 10倍対物レンズを用いて顕微鏡で胚を見つける。イメージング分野内の複数の胚を得るために若い胚のグループのためのワームの本体の近くに見える。最高のイメージのためのワーム内部に胚を避けてください。 </li><li>イメージングのための高倍率（100倍に40倍）と分解能（1.4〜NA 0.9）客観的にソフトスイッチを使用する。 </li><li> 、ノマルスキー微分干渉光学系を（次のWebサイトが参考になったDIC光学の説明や用語が含まれている調整する<a href="http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html">http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/dic/dichome.html</a> http://microscopy.berkeley.edu/Resources/instruction/DIC.html） <ol class="lalpha"><li>私たちのオリンパスBX61上重要なコンポーネントは次のとおりです。 <ol><li>偏光板 - コンデンサーの下のスライダ</li><li>コンデンサーウォラストンプリズム - タレットコンデンサーで、ちょうどステージの下。 </li><li>客観的なウォラストンプリズム - フィルタキューブの下のスライダ</li><li>第2の偏光板（アナライザ） - DICの位置でフィルターキューブ</li></ol></li><li>光路（ソフトウェアが起動時にこれを実行してください）で分析（第2の偏光板）を配置するためにDICにフィルターキューブを切り替えます。 </li><li> 2枚の偏光板が適切に（交差）合っていることを確認してください。両方ウォラストンプリズムは光路から外れているときに視野が暗くなるはず。必要に応じてこれが正しくなるまで、コンデンサー下の偏光板を回転させる。 </li><li>光路内に目標（上段）ウォラストンプリズムを挿入します。 </li><li>使用している客観的に一致するウォラストンプリズムを選択するためにコンデンサーでタレットを回転させる。 </li><li>レンズのNAに合わせて、この櫓の下のスライダを調整します。 </li><li>最適なケーラー照明用のコンデンサーを当てる。 </li><li>上部のウォラストンぷりを調整するSMは、スライダーのつまみを回転させることで最適なコントラストを得るために。 </li><li>ソフトウェアの起動によって制御されるその他の設定は、カメラのゲイン（0に設定）と、8ビットではない16ビットのTIFFファイルとして保存するファイルへの切り替えが含まれています。 </li></ol></li><li>素敵なイメージを与えるために光のレベルを調整します。 （通常は4.7ボルトを使用）（ソフトウェア経由で制御）。我々は、最も明るいピクセルがちょうど飽和レベルより下になるようにサンプルを照らすために好む。 胚における卵黄顆粒が明らかに目立つ3次元的な顔で画像の良好なDIC光学結果。これはサンプルを照らす光は、試料の片側（またはサンプルの機能）などの角度から照らすように見えるかのように記述することができる代わりに明るく点灯し、反対側は影にあり、暗く表示されます。 </li><li>あなたがイメージする胚を含むように関心領域（ROI）を選択し、ウィンドウを減らすためにROIのボタンを設定]をクリックします。 </li><li>多次元収集ウィンドウを開きます。 Z -スタック（スライス）と時間のポイント]を選択します。 </li><li>胚の底部（フォーカスのある卵黄顆粒と最後の焦点面）を見つけるために顕微鏡のフォーカスノブを使用してください。選択底をクリックしてください。胚の上部を識別し、設定する手順を繰り返します。我々は通常、1ミクロンのステップサイズを使用し、〜20の焦点面で終わる。胚や細胞が比較的厚いので、我々は一般に各時点で、複数の焦点面を収集する。さらに、細胞が異なる方向に分割するために始める場合は特に、彼らは元の焦点面の内外に移動させる胚の周りに他のセルを置換することができます。あなたの顕微鏡は、フォーカスモータを持っていない場合は、手動で興味のある方は、セルまたはプロセスに従うようフォーカスを調整することができます。 </li><li>必要な時点との時間間隔の入力数。我々は、通常15秒間隔を使用し、500時間ポイントの最大値を設定します。我々は、必要な時に我々が取得を必要とすると停止できますより多くの時点で始まります。あなたがイメージング複数の焦点面である場合、タイムポイント間の間隔の焦点面のすべてを取得するのに十分な時間があることを確認してください。 </li><li>データを保存する場所を選択または作成します。ソフトウェアは、最後の画像を表示するように設定されていることを確認してください。ファイルに名前を付けて取得]をクリックします。それが正常に動作しているように、最初にいくつかの時間ポイントの自動画像収集を監視します。 </li><li>あなたが10倍目標に買収、スイッチを停止し、次のスライドを準備したいときは、[停止]をクリックします。 </li><li>終了したらイメージングは​​、光パスからDICのコンポーネントを削除します。客観的な必要に応じてオフクリーンなオイル。カメラから始まるオフすべてを切ります。 </li></ol> GFP作品<ol start="20"><li>顕微鏡を起動し、上記のように胚を見つける。蛍光シャッターのソフトウェア制御を含む構成ファイルを使用してください。 </li><li>上部のDICプリズム（スライダ）は、光パス内にないことを確認してください。 </li><li> FITC / GFPにフィルターキューブを切り替えて（起動時に自動的に設定） </li><li> 16ビットTIFF（自動的にこの設定ファイルと起動時に設定）に255のカメラのゲインとイメージファイルを変更します。 </li><li>白色光をオフにします。 </li><li>プレビュー画像に画像をライブ]をクリックします。光曝露を最小限に抑えるために迅速に働く。また、単一の画像を収集するスナップ画像を使用してください。 </li><li>良い画像を得るために水銀球のパワー/ NDフィルター、露出の長さを調整します。一般的に、あなたは蛍光シグナルのセルと退色する光損傷を軽減するデータを取得するサンプルを到達minimum光を使用する必要があります。 </li><li>時間間隔、時間のポイント数と焦点面の数を設定します。私たちはしばしば50〜10秒間隔と1-3焦点面を使用してください。 </li><li> ROIを選択して、以前のステップ13から19で説明したように画像取得のためのパラメータを設定します。 </li></ol>分析する作品<ol start="29"><li>データは入力したと4Dスタックの各イメージのTIFFファイルの一連の、テキストフ​​ァイルや、暴露レベルと時間間隔などのメタデータを含むXMLファイルを含む名前のフォルダに保存されます。 </li><li> TIFF画像は、2つのメソッドを介してImageJを開くことができます。 （方法a）最初は、最も単純であり、また、各ファイルのメタデータが読み取られます。 （方法b）第二はImageJに割り当てられるメモリの量よりも大きなサイズのファイルを開くために仮想メモリを使用することが可能ですが、それはメタデータが含まれていません。 <ol class="lalpha"><li>マイクロマネージャーのプラグインを使用する<ol><li>マイクロマネージャーは上に構築し、ImageJを使用しています（それはあなたが以前にインストールされている可能性がある他のバージョンと異なるものになるImageJの新しいバージョンをインストール）し、データを開くにはプラグインが組み込まれています。別の方法としては、ImageJの別のバージョンのプラグインフォルダにMicro-Manager-1.3/pluginsのフォルダの内容をコピーすることができます。 </li><li> Pluginsメニューに移動し、マイクロマネージャーと[開く]マイクロマネージャーのファイル]を選択します。 </li><li>を表示し、[OK]をクリックしたいデータを含むフォルダを選択します。 </li><li> ZとT寸法で再生。 </li></ol></li><li> plugi遺伝子座を使用したBioFormatsインポーターでムービーを開くにはnを入力。 <ol><li> tiffファイルを含むフォルダからxmlとtxtファイルを転送し、データセットの名前を一致させるには、2つのファイルの名前を変更します。 </li><li> ImageJの内、データブラウザやバイオフォーマットのどちらかして輸入を、プルダウンメニューLOCIを選択し、プラグインにアクセスしてください。 </li><li>あなたのTIFFスタックを持つフォルダを見つける。オープン後、最初のTIFFファイルをクリックしてください。 </li><li> Hyperstackでスタックを表示します。データセットの組織の下：同じ名前が、スワップの大きさとグループファイルを選択して、すべてのシリーズを開きます。メモリ管理の下で：選択してください：（特に大きなデータセットの場合）の仮想スタックを使用してください。 [OK]をクリック</li><li>プラグインは、データセットの次元を決定する（＃タイムポイントと焦点面の）と&lt;&gt;括弧のセットの間の範囲が表示されます。 [OK]をクリックするか、時間のポイントおよび/または開くように焦点面の数を変える。 </li><li>各シリーズに対応する寸法を確認してください。 </li><li> ZとT寸法で再生。 </li></ol></li></ol></li></ol>代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig1.jpg" alt="図1" /> 図1初期のC.の間に正常な細胞事象を示すノマルスキー微分干渉ムービーから静止画elegansの胚発生：前核移行（0-5:45）、非対称第一分裂（6:45-14:45）と非同期第二事業部（14:45-27:00）。データは、60倍1.35 NAのレンズで集めていた。 1ミクロン間隔で20の焦点面は、40μsの曝露では15秒ごとに収集された。その後方では右と腹ダウンしていることですので、画像が回転させた。スケールバーは10ミクロンを表す。 <img src="/files/ftp_upload/2625/2625fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。中期から初期の後期（Cまで）後期にスピンドルmidzoneに表示される前までに染色体上に存在する染色体パッセンジャー複合体のGFP標識サブユニット（AIR - 2）のダイナミックな動きを示す蛍光映画からスティルス細胞質分裂が完了すると（FのC）。データは、60倍1.35 NAのレンズで集めていた。単焦点面を50マイクロ秒露光で10秒ごとに収集されました。その後部が右になるように画像が回転させた。スケールバーは10ミクロンを表す。 ムービー1野生型胚のノマルスキームービー。 図1を対応するムービー。後部には、右の腹底になります左下にあります。元のデータセットの単一の焦点面を示しています。画像はバック毎秒14コマに設定されて15秒ごとと遊びを集めていた。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2625/Movie1.mp4">ビデオを見るためにここをクリック</a> GFPを発現する野生型胚の動画2蛍光ムービー：：AIR - 2。 図2に対応する映画。後部には、右上にあります。映画は単焦点面として回収した。画像は10秒ごとに、プレイバック毎秒14コマに設定されて回収された。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2625/Movie2.mp4">ビデオを見るにはここをクリック</a>

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利害の衝突は宣言されません。

ライブタイムラプスイメージングのための主要な考慮事項は、細胞や生物の完全性と実行可能性を維持することです。 DIC顕微鏡は、試料を照明光源からの紫外線や過度の加熱にさらされていないことの利点を提供します。 DIC顕微鏡は、よく細胞遊走や細胞質分裂などの細胞の形状変化を検出し、そのような有糸分裂紡錘体や核膜などのいくつかの細胞内構造を、識別するために適しています。レポータータンパク質の蛍光イメージングは​​、追加の細胞内コンパートメントを特定し、特定のタンパク質の可視化を可能にすることによってDIC顕微鏡を補完します。蛍光イメージングの間に胚に光毒性と被害の危険性を軽減するために、我々は、通常照明の削減のUV光の強度と持続時間を相殺するためにカメラのデジタルゲインを増加させる。微弱な蛍光トランスジェニックレポーターのために、バックグラウンドを減らすために焦点のずれた光やぼけ修正アルゴリズムを再割り当てするデコンボリューションアルゴリズムにより、撮影した画像の品質を向上させることができます。このような共焦点顕微鏡や多光子システムなどの高度な顕微鏡は、時々必要であるが、我々は高品質な画像をもたらし、多くの蛍光レポーターがこの落射蛍光顕微鏡のセットアップを使用して画像化することができることを見出した。 マイクロマネージャーは（http://www.micro-manager.org）、無料であることに加えて、代わりに多くの商用ソフトウェアパッケージの独自のファイル形式のTIFF形式への直接フ​​ァイルを保存します。これは大幅にImageJを、Photoshopや他の画像編集ソフトで画像ファイルを読み込むために必要なファイルの変換ステップを排除することによって私たちのデータの分析を簡素化します。

浜松オルカ- ERのカメラでオリンパスBX61顕微鏡。 10倍プランの蛍石（NA 0.3）と60倍PlanAchromat（NA 1.35）の対物レンズマイクロマネージャ1.3.46（http://www.micro-manager.org） 画像J 1.43（http://rsbweb.nih.gov/ij） loci_tools.jar（http://www.loci.wisc.edu） アガロース - 分子生物学/ゲル電気泳動グレードフィッシャーSuperfrost /プラス顕微鏡スライド（カタログ番号12-550-15） 実験室のテープ（フィッシャーカタログ＃15から901シリーズ） 18ミリメートルx 18のmm＃1.5カバーグラス M9（242 mMのKH 2 PO 4、40mMののNa 2 HPO 4、9ミリグラムのNaCl、19 mMのNH 4 Clをし、MgSO 4） （http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm）。 卵バッファー（118 mM塩化ナトリウム、48 mMの塩化カリウム、2mMのCaCl 2を 、2mMのMgCl 2、25mMのHEPES、pH7.3）を25。 ワセリンブラシ/スティック剃刀の刃ヒートブロック解剖顕微鏡ワーム22 白金線は、22を選ぶ 27G1 / 2精密グライドニードル（ベックトンディッキンソン）や小さな刃を持つメス

imaging c. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software

このような染色体の組み立て、偏析や細胞質分裂などの細胞プロセスは、本質的に動的です。蛍光標識レポータータンパク質または微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡を用いた生細胞のタイムラプスイメージングが、そうでない場合は、固定サンプル1,2の分析から推論されるこれらの動的なイベントの時間的進行の検査が可能になります。また、細胞プロセスの開発規制の研究は、開発中に無傷の生物にタイムラプス実験を必要とする。 Caenorhabiditis elegansの胚は、このように4,5と開発6月9日細胞生物学の質問を研究するための理想的な実験モデルを提供する、光透過的であり、3系統知られている細胞と急速な、不変の発生プログラムを持っています。C.は虫は前進遺伝学（ランダム変異誘発10,11に基づいて）と特定の遺伝子を標的とする逆遺伝学（RNAiによる干渉に基づいており、変異導入12月15日を対象）で遺伝子操作に修正可能です。さらに、トランスジェニック動物が容易に蛍光タグタンパク質や記者16,17を表現するために作成することができます。これらの特性はそれが容易にin vivoで 18から21 に基本的な細胞や発生過程を制御する遺伝的経路を識別できるように組み合わせる。このプロトコルでは、Cのライブイメージングのための方法を提示化合物落射蛍光顕微鏡でDIC光学系やGFPの蛍光を用いて線虫の胚。我々は通常、固定サンプルのイメージングに使用容易に利用できる顕微鏡が、、また、イメージングプロセスを自動化するオープンソースのソフトウェアを使用してタイムラプス解析に適用することができる容易さを示しています。

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Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

市販<em&gt; C.エレガンス</em&gt;胚は、細胞生物学と開発を研究するための強力なシステムです。我々はのライブイメージングのためのプロトコルを提示<em&gt; C.エレガンス</em&gt;容易に入手できる落射蛍光顕微鏡とオープンソースソフトウェアを使用してDIC光学系や蛍光を利用した胚。

イメージング C.エレガンス</em落射蛍光顕微鏡とオープンソースソフトウェアを使用して>胚

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

27.7K ビュー.  University of Michigan. 市販 C.エレガンス胚は、細胞生物学と開発を研究するための強力なシステムです。我々はのライブイメージングのためのプロトコルを提示 C.エレガンス容易に入手できる落射蛍光顕微鏡とオープンソースソフトウェアを使用してDIC光学系や蛍光を利用した胚。

ビデオ: Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

生物学

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

の調製ショウジョウバエ</emハンギングドロッププロトコルを使用してライブイメージングのための>胚

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The apertureless near-field microscope is a light scattering-type instrument that provides infrared spectra at circa 20 nm resolution. A complete list of components and a step-by-step protocol for use is provided.  Common errors in assembly and instrument tuning are discussed.  A representative data set that shows the secondary structure of an amyloid fibril is presented.  

The assembly of a nearfield infrared microscope for imaging protein aggregates is described.

アセンブリは、チューニングとタンパク質イメージングのためApertureless近距離赤外線顕微鏡の使用

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

における酸素欠乏によって誘導された仮死状態を可視化するために時間の経過顕微​​鏡の使用<em&gt; Cエレガンス</em&gt;胚

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegansの走化性アッセイ

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

抗体染色中<em&gt; C.虫</em&gt;「フリーズクラッキング」使用

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

上の細菌の影響を測定する<em&gt; C.エレガンス</em卵保持アッセイを用いて&gt;行動

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

における虚血/再灌流のための無酸素飢餓モデル<em&gt; C.虫</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

のための簡単​​なシート光顕微鏡を設定する<em&gt;トトで</em&gt;イメージングの<em&gt; C.虫</em&gt;開発

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly dependent on modes of single-cell analysis. Methods which deliver composite data reflecting the mean values of biomarkers from cell populations risk losing subpopulation dynamics that reflect the heterogeneity of the studied biological system. In keeping with this, traditional approaches are being replaced by, or supported with, more sophisticated forms of cellular assay developed to allow assessment by high-content microscopy. These assays potentially generate large numbers of images of fluorescent biomarkers, which enabled by accompanying proprietary software packages, allows for multi-parametric measurements per cell. However, the relatively high capital costs and overspecialization of many of these devices have prevented their accessibility to many investigators.
Described here is a universally applicable workflow for the quantification of multiple fluorescent marker intensities from specific subcellular regions of individual cells suitable for use with images from most fluorescent microscopes. Key to this workflow is the implementation of the freely available Cell Profiler software1&#160;to distinguish individual cells in these images, segment them into defined subcellular regions and deliver fluorescence marker intensity values specific to these regions. The extraction of individual cell intensity values from image data is the central purpose of this workflow and will be illustrated with the analysis of control data from a siRNA screen for G1 checkpoint regulators in adherent human cells. However, the workflow presented here can be applied to analysis of data from other means of cell perturbation (e.g., compound screens) and other forms of fluorescence based cellular markers and thus should be useful for a wide range of laboratories.

Presented is a flexible informatics workflow enabling multiplexed image-based analysis of fluorescently labeled cells. The workflow quantifies nuclear and cytoplasmic markers and computes marker translocation between these compartments. Procedures are provided for perturbation of cells using siRNA and reliable methodology for marker detection by indirect immunofluorescence in 96-well formats.

高コンテンツ、オープンソースソフトウェアでサポートされているユニバーサル顕微鏡データからの蛍光マーカー、個々の細胞定量のワークフロー

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

イメージング C.エレガンス胚