我々はすべてコールドウェル研究室のメンバーの協力精神を認識したい。ラボにおける運動障害の研究は、バッハマン-シュトラウスジストニア＆パーキンソン財団、米国パーキンソン財団、米国パーキンソン病協会、アラバマ州のパーキンソン病協会、パーキンソン病研究のためのマイケルJフォックス財団、および学部研究によってサポートされています。

発現プラスミドの構築二つのプラスミドが必要です。興味と選択可能な形質転換マーカーとしての第二の遺伝子の組織特異的発現のための1つを。 実験的なプラスミド<ol><li>例えば、関心の組織/細胞型で発現するプロモーター、、神経または筋肉特異的プロモーターを選択してください。一同一組織内の複数の遺伝子を発現する場合、ゲートウェイシステム（インビトロジェン社）でプラスミドのプロモーターカセットを使用することができます。このアプローチは、組換えクローニングの4によるプロモーターの関心の下流に任意の遺伝子の挿入が可能になります。一般に、上流配列の2-5 KBが正しいと正確な表現を持つのに十分である。 </li><li>目的の遺伝子のcDNAは、2つの方法でクローニングすることができる。 <ol><li>制限酵素を用いて従来のクローニング。 </li><li>ゲートウェイのクローニングの場合、それは、PCRは、ゲートウェイATT B組換え配列を含むプライマーを用いて増幅される。増幅したcDNAは、最初のエントリのベクトルを作成するにはドナーベクターのpDONR201に再結合して、E.に変換されます大腸菌株DH5a。成功した組換え体とDNAのミニプレップ分離の選択後、エントリーベクターは、プロモーターを含む発現プラスミドを作成するデスティネーションベクターに再結合されています。組み換えクローン作成の詳細については、InvitrogenのGatewayのマニュアルから、またはコールドウェルらで用意されています。5。 </li></ol></li></ol>プラスミド選択可能なマーカートランスジェニックマーカープラスミドの例としては、ROL - 6または蛍光タンパク質の発現を駆動するために体壁筋のプロモーターUNC - 54の使用を含む。これらのマーカープラスミドは、要求に応じて研究コミュニティ内から通常ご利用いただけます。 C. elegansのマイクロインジェクション準備<ol><li>注入される2つのプラスミドのDNAの分離を実行します。それらを定量し、50 ng /μlにそれぞれの1:1の比率で混ぜる。 </li><li>寒天パッドを準備します。 <ol><li>溶けるまで熱やマイクロ波、2％アガロース水溶液を加えます。 </li><li>ベンチトップ上で複数の22 × 50mmのカバーガラスを設定します。 </li><li>パスツールピペットを使用して、1のカバーガラス上に溶融アガロースのドロップを配置し、すぐに最初に90の角度で降下上に第2カバーガラスを配置。他のいくつかのカバーガラスについて、この手順を繰り返します。アガロースの平坦化されたディスクの直径は15〜20 mmの間でなければなりません。 </li><li>アガロースが（これは時間がかかりますのみ）固化した後、カバーガラスを削除し（一晩に数時間）パッドが完全に空気乾燥することができます。 </li><li>室温でカバーガラスのボックスにパッドを保管してください。 </li></ol></li><li> DNA溶液のための針のローダーを作成します。 針ローダーは、直火上の真ん中で加熱し、急速に約2倍の長さに引っ張られて、100μlのキャピラリーチューブから作成されます。キャピラリーチューブの温度が下がると、次の2つの半分は離れてスナップされる。注射10〜20針ローダーを備蓄する。マイクロチューブのラックに垂直に保管してください。使用するには、ポイントに身を突き刺すようにすることを注意してください 。 </li><li>マイクロインジェクションの針を作る： 針は、内部のガラスフィラメントを含む特殊なキャピラリーチューブから作られ、このフィラメントは、DNA溶液のための芯となっています。これらは、針 - プラーのマシン上でプルアップされています。我々は24.8の熱設定でナリシゲPP - 830プーラーを使用してください。いくつかの針が一度に引き下げられ、小さなプラスチックの箱に格納されています。複数の針は容易に長期保存のための粘土のストリップの&quot;マウント&quot;することができます。 </li><li>針の先端&quot;ブレーカー&quot;： マイクロインジェクションの針の先端は、それが実際にそれで終わりに閉じられるよううまく引き出されており、カバーガラスの小さな破片を使用して開いて分割する必要があります。これらは、ペーパータオルで18 × 18 mmのカバーガラスをラッピングして、いくつかの部分に分解するまでゆっくりと圧力を加えることによって調製される。便利なサイズの断片は、約3 × 4 mmである。 </li><li>標準的な手順6を使用して注入するための早期成人の段階に野生型（N2）ワームが成長する。約100の準備が適切にワームを上演/注入構築。 </li></ol>手順<ol><li>マイクロインジェクションニードルアームとホルダーに接続されているヘリウムタンク上のメインバルブを開きます。ガスは35 psiに圧力をもたらし、ラインを入力できるようにするレギュレータバルブを閉じます。ガスは、フットペダルを使用して解放することができることに注意してください。 </li><li>標準的な口のピペッターチューブ（ガラスキャピラリーチューブの容器に見られる）に針のローダを挿入し、プラスミド混合物（〜1μl）を少量のを描く。 </li><li>針のローダーは、の長さを介してすべての道を慎重に注射針のバックエンドに配置し、静かに挿入されます抵抗までの針が感じられる。軽く吹いてDNA溶液を追放し、ローダーを削除してください。 </li><li>小さな内部のゴム製のガスケット内に配置するように注意して、マイクロインジェクションの腕に針を挿入します。 </li><li>寒天のパッドの1つのエッジでカバーガラスの針破りのシャードを置きます。ハロカーボンのオイルで、シャードだけでなく、寒天のパッドの表面全体をカバーしています。倒立顕微鏡のステージ上の寒天のパッドを配置。 </li><li> 4X目的と明視野照明を使用して表示するフィールドの中央に針を置き、まだ石油に下ろしていない。また、中央のカバーガラスの破片の内縁の位置、それに焦点を当てて（まだ4X対物レンズを用いて）。カバーガラスの破片と同じ焦点面に取り込む、油に針を下ろします。 40X客観的に切り替えることで倍率を上げる。シャードの端に再び集中し、必要に応じて、針の先端の位置を変えます。 </li><li>フットペダルを介してガスの短いパルスを印加すると同時に、注射針の先端を開放し、穏やかに、カバーガラス破片の端に針を微調整する。液体の小さな液滴が針の端をエスケープするときに針が十分に開いて壊れてしまいます。それは動物を殺すので、あまり大きな開口部に起因する過剰な液体の​​流れは、望ましいことではありません。 </li><li>針を上げることによって段階から寒天のパッドを取り出し、しかしX -またはY軸の位置を変更しないでください。針の下からステージをスライドさせ、寒天のパッドを削除し、解剖顕微鏡の上に置きます。油の表面の下に、パッド上にワームを転送します。ワームの蠢く、やさしくストロークの場合、それが接触寒天パッドをするまで。湿ったワームは、乾燥したアガロースに従う必要があります。 </li><li>注射<ol><li>素早く視野にワームを中心に、バックステージ上に寒天のパッドを配置。 </li><li>ワームのような焦点の同じ面に針を下ろします。 </li><li>ホフマン照明（コントラストのフィルタの種類）にフィルタを切り替えます。これは、ワームの形態学的詳細が見えるようになることができます。ノマルスキー/ DIC光学系も同様に動作する倒立スコープで利用可能な場合。 40Xの目的を使用して、胚の核の&quot;ハニカム&quot;パターン下のワームの生殖腺の&quot;粗い&quot;RSウイルスセンター、（針が直面しているワームの側に配置されている方性腺選択）に焦点を当てる。 </li><li>微調整のヒントがフォーカスにもなるまで、針の位置（生殖腺&quot;粒状感&quot;と同じ平面）。 </li><li>ゆっくりと生殖腺の中央に針を挿入し、生殖腺の腕へのDNAの液滴または2つを追放するためにガス圧の短いパルスを適用する。あなたは、遠位生殖腺での液体拡散の波を観察する必要があります。あまりにも多くの液体は、卵母細胞の生産を停止することができます性腺腕の近位曲がり、に流れることができるので、より多くの液体は、優れていると仮定しないでください。可能であれば、ワームの位置に応じて、同じ方法で他の生殖腺の腕を注入する。 </li><li>それは容易に乾燥させることができるとして、それは、ワームを注入しながら迅速に作業することが重要です。第二生殖腺のアームを注入するという決定は、針とワームを再配置できる方法を迅速に依存している。全体のプロセスは、理想的に1〜2分未満を取る必要があります。 </li></ol></li><li>ステージからカバーガラスを外し、解剖範囲の上に置きます。直接注入されたワームの上にM9バッファー（22mmのKH 2 PO 4、42mMのNa 2 HPO 4、85ミリメートルのNaCl、1mMのMgSO 4）し（これは、ハロカーボンオイルの表面下にピペットの先端を沈める伴うかもしれない）1μlの適用されます。バッファは、ワームを水分補給をする必要があります。これは、アガロースパッドの表面をオフにフロートします。ワームのピックを使用して、通常のプレートにワームを転送します。それはバッファと、もはや付着ワームにあまりにも飽和状態になるまでアガロースパッドはいくつかのより多くの回を再利用することができます。 </li></ol>トランスジェニック選択<ol><li>注入されたワーム、P 0の世代は、個々の新鮮な、細菌接種したプレート（60 mm）に移して再現するために許可されています。子孫が表示されるまで、一般的に、注入された動物は、2〜3日間20℃でインキュベートする。 </li><li> F 1個体は、蛍光実体顕微鏡を用いてトランスジェニックマーカー（など蛍光など）の証拠が観察されています。各蛍光灯、キャリアF 1、動物は個別に（それぞれF 1から子孫ので明確な線とみなされる）新しいプレート上に複製されます。 F 1雌雄同体を再現するために許可されています。子孫が表示されるまで、再び、これは一般に20℃2〜3日間で行われます。 </li><li> F 2世代は、同様にトランスジェニック動物で観察される。継承とトランスジェニック配列を表現しているF 2動物は&quot;安定的&quot;行とみなされます。 注：F 第1回で年齢は、多くのトランスジェニック動物があるかもしれませんが、彼らは安定していないです。 F 1トランスジェニック動物の大半は、F 2、安定した回線に伝播されません。 注：遺伝子のコピー数の変動を制御するために、注入された構築ごとに3つの独立した安定した線の最小値を生成する。 </li><li>それぞれ独立した安定したラインは、ワームの個別の行として維持されるべきである。各行は、各世代で新しいプレートにいくつかのトランスジェニック動物を移すことによって伝播することができます。選択可能なマーカーが蛍光灯の場合、これは蛍光実体顕微鏡を使用して実行する必要があります。 </li></ol>

<ol>
	<li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans.">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+requirements+for+somatic+and+germline+expression+of+a+generally+expressed+Caenorhabditis+elegans+gene.">Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene.</a> Genetics. 146, 227-238 (1997).</li><li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans.">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li><li>Caldwell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li></ol>

この手順を行うとき、それは覚えておくことが重要です。 - 生殖腺の中央に直接注入する - あまりにも多くの液体を注入しない - dessicationを防ぐために迅速に働く。 もしそれが大きすぎて壊れているような針、で問題に直面している場合、それはむしろ理想的な針よりも小さいと注入しようとするよりも、新鮮な針を再作成するのが最善です。 トランスジェニックワームの発生は、...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Ultrapure</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Halocarbon Oil, Voltalef</td>
<td>Hulle 10S</td>
<td>elfatochem, France</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 18x18 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-548-A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 20x30 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-548-5A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 22x50 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-545-E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 ul Capillary</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>53432-921</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillary for Needles</td>
<td>"Kwik-Fil"</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>1B100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Puller</td>
<td>Tool</td>
<td>Narishige</td>
<td>Model PP-830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microINJECTOR System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tritech Research</td>
<td>MINJ-1000</td>
<td>Scope, Stage, Manipulator</td>
</tr>
<tr>
<td>Dissecting, with Fluorescence</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ645</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

generation of stable transgenic c. elegans using microinjection

トランスジェニック線虫（Caenorhabditis elegans）は、容易に生殖腺1内へのDNAプラスミド溶液のマイクロインジェクションを使用して作成することができます。プラスミドDNAは安定して実際の染色体の2と同じ効率でも、ではない継承されている体外コンカテマーを形成するために再配置。目的の遺伝子は、解剖顕微鏡下でトランスジェニック動物の選択を可能にするために、そのようなROL - 6やGFPなどの明らかな表現型マーカーと共注入されます。外来遺伝子は、細胞内局在の研究のためにその天然のプロモーターから発現させることができる。また、導入遺伝子は、その特定の細胞または組織における遺伝子産物の役割を評価するために、異なる組織特異的プロモーターによって駆動することができます。この手法は、効率的に生殖細胞または初期胚3以外C. elegansの全組織での遺伝子発現を駆動します。トランスジェニック動物の作成は、広く実験的なパラダイムの範囲に利用されている。このビデオでは、トランスジェニックワームを生成するためにマイクロインジェクションの手順を示しています。さらに、安定したトランスジェニック線虫の行の選択と維持管理が記載されている。

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Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

このビデオでは、トランスジェニック動物を作成するために線虫の生殖巣にマイクロインジェクションのテクニックを示しています。

マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

generation-of-stable-transgenic-c-elegans-using-microinjection

Research

JoVE Journal

Biology

52.6K ビュー.  University of Alabama. このビデオでは、トランスジェニック動物を作成するために線虫の生殖巣にマイクロインジェクションのテクニックを示しています。

ビデオ: Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

トランスジェニック蚊を取得するA.ネッタイシマカの胚のマイクロインジェクション

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

生物学

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

トランスジェニックの世代 C.エレガンスバイオリスティック変換による

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

イメージング C.エレガンス</em落射蛍光顕微鏡とオープンソースソフトウェアを使用して>胚

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

シトクロムの細胞質マイクロインジェクションによるアポトーシスの活性化 C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

で遺伝子発現プロファイルを決定 C.エレガンスマイクロアレイとリアルタイムPCRを用いて

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegansの走化性アッセイ

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

抗体染色中<em&gt; C.虫</em&gt;「フリーズクラッキング」使用

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

上の細菌の影響を測定する<em&gt; C.エレガンス</em卵保持アッセイを用いて&gt;行動

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

トランスジェニックの世代<em&gt;ハイドラ</em&gt;胚マイクロインジェクションによる

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

拡散とプリオン様タンパク質の毒性は後生動物モデル生物を用いて調査<em&gt; C。エレガンス</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...