まず、検査のために患者の血清または脳脊髄液サンプルに希釈液を準備します。0.05%Evans BlueでPBSで希釈することにより、必要なコンジュゲートを適切な使用濃度で調製します。間接蛍光抗体検査では、アッセイに必要な適切な数の抗原スライドを調製します。
スライドを解凍して完全に乾かします。次に、スライドをアセトンで満たされたコプリンジャーに入れ、可燃性物質用に承認された摂氏マイナス20度の冷凍庫に2時間から一晩移します。その後、スライドをアセトンから取り出し、風乾させます。
次に、スライドをバイオセーフティキャビネット内の湿度チャンバーボックスに置きます。湿度を維持するには、蒸留水に浸した吸収ストリップをチャンバーに追加します。各コントロールサンプル、サンプル希釈液、またはPBSを所定のウェルに50マイクロリットル塗布します。
密閉した湿度スライドチャンバーを摂氏37度、5%二酸化炭素湿度インキュベーターに30分間置きます。完了したら、インキュベーターから湿度スライドチャンバーを取り外し、バイオセーフティキャビネットに移します。アスピレーターチップを使用して、細胞単層を乱すことなく、各ウェルから上清を慎重に吸引します。
その後、滅菌スポイトピペットを使用して各ウェルにPBSを1滴塗布します。PBSを慎重に吸引し、各スライドをPBSで満たされたCoplinジャーに移します。次に、スライドを湿度チャンバーボックスに戻します。
50マイクロリットルの適切な抗ヒト抗体コンジュゲートを各ウェルに塗布し、湿気のあるインキュベーターで30分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、湿度チャンバーをバイオセーフティキャビネットに移します。アスピレーターチップを使用して上澄み液を吸引します。
その後、滅菌スポイトピペットを使用して各ウェルにPBSを1滴塗布します。PBSを除去した後、PBSのCoplinジャーでスライドを合計15分間2回洗浄します。洗浄したら、スライドを自然乾燥させてから、カバースリップに封入剤を取り付けます。
スライドを手に取り、蛍光顕微鏡で読みます。サンプルをネガティブから4プラスまでグレーディングし、陰性サンプルは蛍光を示さず、4プラスサンプルは明るい緑色の蛍光を示します。サンプルと、サンプルが 1 から 2 プラスのグレードを示す希釈係数で表されるエンドポイント値を割り当てます。
最初のワクチン接種後、患者サンプルで免疫グロブリンMとGの両方の高レベルが観察されました。ワクチン接種から約6カ月後、患者検体には両方の抗体のレベルが有意に低下したが、免疫グロブリンMレベルはほぼ完全に低下していた。ワクチン接種から18カ月後、免疫グロブリンM抗体は患者検体から検出されなかった。
免疫グロブリンGレベルは、2週間の時点からの最初の低下に続いて、6か月の時点で検出されたものと同様に持続し、とどまりました。.
