このプロトコルは、活動の集中レベルでの分子立体構造に、フィールド内のディクテーションの初期のビューから動物狂犬病の死後の診断に使用することができます。急速な免疫クロマトグラフィー診断検査は、狂犬病診断のための参考資料が利用できないアフリカおよびアジアの農村部および農村の形質に有用な代替手段である。手順を実証することは、私の研究室の技術者サイモン・ボナスになります。
手順の最初の部分を実証するのは、マリのバマコにあるラボラトイレ中央ヴェテリネールの技術であるイブラヒマ・ディッコです。前部のマグナムにアクセスするには、最初の頸椎の前に動物の頭部を取り除くためにナイフを使用してください。そして、脳幹サンプルを収集するために適切なツールを使用してください。
例えば、使い捨てピペット、ストロー、クランプ、またはドロッパーなど。脳幹は、このピペットの先端でここに示すようにはっきりと見えます。飲むわらなど、この脳幹の一部を収集するのに適切なツールを使用します。.
慎重に挿入し、脳組織を収集するために穏やかに回します。生検を収集するために、それを削除する前に、指でストローを差し込むことを忘れないでください。クランプの使用も可能です。
脳の大きな部分を、前兆のマグナナムのレベルで収集するために。あるいは、キットに設けられているスポイトを直接使用して脳幹を採取することができる。ストローを飲むのと同様に、押しながら慎重にスポイトを挿入し、脳組織を収集するために穏やかに回します。
その後、脳組織を吸引し、チューブのストッパーのような容器に入れます。正確な診断のためには、サンプル採取中に髄質アブロンガタを含む脳幹を採取することが重要である。均質な懸濁液が得られるまで、綿棒またはスポイトを含むチューブ内で約30秒間、脳材料を慎重に粉砕します。
スポイトを用いて、試験装置のサンプル入口に懸濁液を約100マイクロリットルの4滴入水する。高粘度懸濁液による遅延の場合や移行開始を加速させる場合は、デバイスの下端をドロッパーで軽く引っ掻きます。テスト デバイスを読み取る前に、完全なサンプル移行を 1 ~ 5 分待ちます。
サンプルは、2本の線が見える狂犬病に対して陽性と見なされます。制御線のみが存在する場合は、負の値。テストラインのみ、または行が表示されない場合は無効です。
デバイスサンプルからRNAを抽出するには、慎重にデバイスを開けてフィルターペーパーを取り外します。サンプルの沈着面積を収集し、サンプルをトリ試薬LSの1ミリリットルに入れる。通常の穏やかな手動攪拌で室温で1時間後、標準的なRNA抽出プロトコルに従ってチューブ上清からRNAを抽出します。メーカーの推奨事項に従ってRNA沈殿を容易にするためにグリコーゲンの2マイクロリットルを追加します。
RNAリサスペンションの最終体積をヌクレアーゼフリー水で50マイクロリットルに調整します。そして、表に従って3種類の逆転写酵素定量PCRアッセイ用のマスターミックス反応液を調製した。表に示すようにプライマーとプローブを使用する。
希釈されたRNAサンプルの5マイクロリットルで。そして、適切な96ウェル反応プレートに重複する3つの異なるアッセイのそれぞれに15マイクロリットルのマスターミックス。各アッセイに適切な正と負のコントロールを各プレートに重複して追加します。
次に、表に示されているように、温度循環条件に従って異なるアッセイを実行します。結果は、表に示すように分析できます。脳生検のコレクションは、高品質のサンプルの収集を保証するために、できるだけ簡単です。
参照技術と比較して、これらのプロトコルを用いた全ての研究室において、迅速な免疫クロマトグラフィー診断試験の感度および特異性が高かった。試験サンプルの累積数に基づいて、全体的な感度と特異性は95%以上であった急速な免疫クロマトグラフィー診断試験は、感染した動物からの脳生検におけるリサウイルスの検出に適している。しかし、リザウイルス抗原のレベルは狂犬病の診断に重要であるため、滴定ウイルス懸濁液を検査する際の検出限界は依然として高いままである。
これらの代表的な結果では、リザウイルスのウイルスポリメラーゼの定量PCRを標的とした二重結合パンリサウイルス逆転写酵素によるRNA検出後に得られ、51陽性の迅速な免疫クロマトグラフィー診断試験のパネルが実施された。さらに、部分核タンパク質遺伝子のヘミネストPCRターゲティングを用いて、14個のサンプルに対してジェノタイピングを行うことができました。RT PCR後に基づく、または追加の長い文字列分析に基づくジェノタイピングのためのテストストリップの診断と抽出。
迅速な免疫クロマトグラフィー診断テストは、迅速かつ正確な狂犬病診断を提供することができます。これは、連続波ベースの監視および制御システムにおける波動機能を維持するために重要です。そして、人間のネネを最小限に抑えます。
