細胞継代前。6ウェルプレートをコールドコート溶液でコーティングし、5%二酸化炭素で摂氏37度で1時間インキュベートし、ヒト多能性幹細胞を含む6ウェルプレートから幹細胞培地を吸引し、各ウェルに1ミリリットルのカルシウムマグネシウムフリーDPBSを添加します。2回目の洗浄後、500マイクロリットルの解離溶液を各ウェルに加え、室温で2〜5分間インキュベートします。
その間に、6ウェルプレートからコーティング溶液を吸引し、各ウェルに1ミリリットルのカルシウムマグネシウムフリーDPBSを添加します。倒立顕微鏡で、細胞の解離過程を観察します。細胞の80〜90%が丸みを帯びて接着しているように見えたら、6ウェルプレートのウェルから解離溶液を吸引します。
次に、10マイクロモルの岩石阻害剤を含む1ミリリットルの幹細胞培地を6ウェルプレートに加えます。10マイクロリットルの解離細胞懸濁液をチューブに加えます。次に、等量のトリパンブルーを加えます。
穏やかに混合し、血球計算盤を使用して細胞を数えます。細胞カウント後、10倍の0.8〜1倍を含むウェルあたり2ミリリットルの幹細胞培地を、1ミリリットルあたり6番目の細胞および10マイクロモルの岩石阻害剤に加えます。プレートを前後左右にすばやく3回動かします。
プレートを摂氏37度、5%の二酸化炭素インキュベーターに入れます。プレートを前後左右にすばやく10回動かしてから、2時間インキュベートします。0日目と4日目は基礎培地の両方を解凍し、氷上でサプリメントを摂取します。
毎日2ミリリットル、中剤1個、洗濯用中1個を摂氏37度の水浴で5分間温めます。次に、6ウェルプレートのウェルから幹細胞培地を吸引し、2ミリリットルの洗浄培地1を加えます。洗浄用培地1を吸引した後、すぐに1日目用培地2ミリリットルをウェルの側面に加えます。
細胞を摂氏37度、5%二酸化炭素で24時間インキュベートします。分化プロセスの 12 日目に、400 マイクロメートルのマイクロウェルを含む 6 ウェルプレートを 2 ミリリットルの付着防止リンス溶液で処理します。倒立顕微鏡で、プレートに気泡がないか観察します。
気泡が見られない場合は、付着防止リンス液を吸引し、すぐに2ミリリットルの洗浄剤2を加えます。次に、膵前駆細胞培地を吸引し、ウェルあたり0.5ミリリットルの解離緩衝液を添加する。細胞を室温で2〜5分間インキュベートします。
ほとんどの細胞が丸みを帯び、まだ接着しているときは、解離バッファーを吸引し、直ちに各ウェルに1ミリリットルの温かいクラスター培地を加えます。P1000ピペットチップを使用して、細胞を静かに解離させ、円を描くように交互に上下にピペッティングし、ウェルの上部から下部に移動して、ウェル全体で細胞を均等に分離します。解離した細胞混合物を50ミリリットルのコニカルチューブに移します。
1ミリリットルのクラスター培地を6ウェルプレートに添加し、残りのすべての細胞を回収します。次に、マイクロウェル6ウェルプレートから洗浄培地2を吸引し、解離した細胞懸濁液を添加する。細胞を摂氏37度で24時間インキュベートします。
翌日、P1000ピペットチップを使用して、マイクロウェル6ウェルプレートから50ミリリットルのコニカルチューブにクラスターをゆっくりと集めます。13日目の培地を1ミリリットル添加して残りのクラスターを回収し、クラスターをチューブに移します。細胞を重力下でチューブの底に5分間自然に沈殿させます。
細胞クラスターを乱すことなく、チューブから上清を慎重に吸引します。次に、13日目の培地2ミリリットルをチューブに加えます。ピペッティングで上下に静かに混合し、クラスターの吸引を避けます。
懸濁液を非常に密着性の低い6ウェルプレートに移します。プレートを前後左右にすばやく6回動かします。細胞を摂氏37度で48時間インキュベートします。
クラスターの免疫蛍光画像は、膵臓のベータ細胞マーカーを共発現するインスリン産生細胞の優勢を示しました。β細胞シグネチャー遺伝子の発現により、約25%の細胞がNkx6.1を発現し、40%がPdx1を発現していることが明らかになりました。グルコース刺激インスリン分泌アッセイ中、MEL1由来クラスターは、低グルコース濃度と比較して、高グルコース濃度に応答して有意に高いレベルのインスリンを分泌しました。
