マウス真皮からの細胞の単離

安楽死させたマウスのバイオセーフティキャビネット内で、適切に剃り、70%エタノールで消毒してプロトコルを実行します。はさみを使用して、動物の腹部に0.5インチの表在性切開を作成します。首と下腹部に向かって正中線に沿って縦に切ります。

さらに、皮膚をフラップして開くために横方向に切り込みを入れます。鈍い鉗子を使用して、動物の胴体の周りを回りながら、首と下腹部の周りの皮膚を横方向に切り取りながら、皮膚を周囲の組織から穏やかに分離します。真皮側を下にして100mmの組織培養プレートに丁寧に皮膚をセットします。

そして、肌ができるだけ伸びていることを確認してください。6ミリリットルのディスパーゼ溶液をプレートに加え、皮膚が完全に覆われていることを確認します。次に、プレートを覆います。

プレートをパラフィルムで包みます。プレートを室温で10分間インキュベートし、外植片を平らにします。翌日、ピペットを使用して、分離された皮膚を含むプレートから液体を取り除きます。

次に、鉗子を使用して、真皮を表皮から分離し、そこから目に見える脂肪組織をすべて取り除きます。そして、分離した真皮を清潔な組織培養プレートに入れます。1X抗生物質-抗真菌溶液を含むDMEM1ミリリットルを培養プレートの真皮に加えます。

プレートを傾けて、プレートの片側に液体を蓄積します。次に、真皮を1〜2平方ミリメートルに細かく刻みます。そして、それらを新しい50ミリリットルの円錐管に移します。

10ミリリットルのコラゲナーゼII型溶液をチューブに加えます。37°Cで2時間インキュベートし、30〜50rpmで連続的に攪拌して真皮を消化します。70ミクロンの細胞ストレーナーで細胞懸濁液をろ過します。

そして、250gで5分間遠心分離します。上清を捨てた後、ペレットを抗生物質-抗真菌剤溶液を含むDMEMの10ミリメートルに再懸濁します。.前述したように、遠心分離する前に40ミクロンの細胞ストレーナーで細胞懸濁液をろ過します。

得られた細胞ペレットを1ミリリットルの完全LEC培地に再懸濁します。次に、コラーゲンコーティングされた60mm組織培養プレートに細胞を完全なLEC培地でプレート化します。細胞をPBSで2回洗浄し、新しいLEC培地を追加することで、2日ごとに培地を交換します。

マウス真皮から単離された細胞の低倍率画像は、混合細胞集団を示した。