光変換は、白血球の居住地および疾患状態の複数の組織部位からの出口ダイナミクスに対する力学的洞察のための白血球出口の定量的分析のための追跡可能なin vivo方法を提供する。さて、ここでは、白血球の皮腫瘍からの追跡の有用性を示す。このアッセイを他の組織や疾患に適用することは、光を投与する能力によってのみ制限される。
この技術の主な利点は、生体内の炎症組織からの出口として免疫細胞集団を移入するのではなく、内因性の定量化を可能にすることです。炎症を誘発するために、つま先ピンチに対する応答の欠如を確認した後、20マイクロピペットを使用して20マイクロリットルのフタル酸ジブチルまたはDBPを投与し、麻酔付きKaedeトランスジェニックマウスの耳のピナの腹側に投与する。DBPを乾燥させた後、アルミ箔のスリットを通して耳を引き、両面テープを使用して、裏側を上向きにしてホイルに耳を平らに固定します。
次に、405ナノメートルの光源の下に直接位置し、100ミリワットの電力で3分間光変換します。ワクシニア感染の場合、麻酔付きKaedeトランスジェニックマウスの耳のピナ上にPBSの10マイクロリットルでワクシニアウイルスの5回10〜6番目のプラーク形成ユニットを投与するためにマイクロピペットを使用し、ピナを25回突く。24時間後、ちょうど実証したように、ピナをフォト変換します。
適切な実験時に、ピナエと子宮頸部リンパ節およびインジナーリンパ節を収穫し、ピンセットの2組を使用して各ピナの腹側と側側を剥離する。次に、リンパ節と耳の内側を下に向けたピナ片を、コラゲターゼDの1ミリリットル当たり1ミリグラム、カルシウムとマグネシウムを含むHBSSで希釈したDNA1ミリリットル当たり80単位を含む24ウェルプレートの個々の井戸に入れる。2本の29本のゲージ針を使用して、各リンパ節カプセルを開け、プレートを37°Cで30分間置きます。
インキュベーションの最後に、消化されたピナとリンパ節組織を別々の70ミクロンナイロン細胞ストレーナーで押し、各組織の単一細胞懸濁液を得る。腫瘍が適切な実験サイズに成長したら、腫瘍部位の周りに新しく再成長した毛皮を剃り、アルミニウム箔の一部に切断された円形の穴を通して腫瘍を引っ張る。腫瘍を405ナノメートルの光源の真下に配置し、200ミリワットの電力で5分間光変換します。
光変換の24時間後、各動物から腫瘍および腕利およびインギナルリンパ節を収穫し、HBSSのコラゲナーゼDおよびDNaseを含む24ウェルプレートの個々のウェル内の腫瘍をミンチするためにはさみを使用する。リンパ節を別々の井戸に入れ、ちょうど実証したようにカプセルを開けろ。腫瘍を摂氏37度で30分間インキュベートし、リンパ節を37°Cで30分間インキュベートした後、消化した組織を別々の70ミクロンストレーナーを介して押して、各組織の単一細胞懸濁液を得る。
フローサイトメトリーによる単一細胞懸濁液を解析するには、まず、ケエデトランスジェニックマウスから脾臓または血液を採取し、塩化アンモニウムカリウムバッファーで赤血球をリセ化する。細胞を1つの未変換のKaede FITCと1つの変換されたKaede PE集団に分割し、PBSの1ミリリットルの単色のKaede PE細胞を24ウェルプレートの1つの井戸に再懸濁し、100mmの電力で405ナノメートルの光源の下で5分間細胞を光変換します。次に、光変換されたKaede PEセルと未変換のKaede FITCセルを使用して、各蛍光チャネルの全範囲の70〜80%に光増倍率電圧を設定します。
Kaedeタンパク質の電圧が設定されたら、メーカーの指示に従って、単一のフルオロフォア標識補償ビーズを使用して他のすべての一次抗体染色を補償します。次に、標準的なフローサイトメトリック解析プロトコルに従ってフローサイトメーター上でサンプルを実行します。光変換暴露直後に耳皮膚または子宮頸部排出リンパ節から発生した単一細胞懸濁液は、皮膚内のすべてのCD45陽性白血球の78%の変換効率を明らかにし、リンパ節の排出には変換された細胞が観察されない。
光変換された耳の中の浸潤CD45陽性白血球の数を定量化して、変換後0時間および24時間、紫光暴露が白血球浸潤の統計的に有意な増加を引き起こすことを明らかにする。しかし、このCD45陽性白血球浸潤の増加は、ワクシニアウイルスなどの強力な炎症性刺激によって誘発される浸潤に対して小さい。光変換はまた、マイルズアッセイによって測定される耳のピネにおける血管透過性を増加させ、用量、暴露時間およびデータ解釈を最適化する際に、組織炎症に対する紫色光の影響を考慮すべきであることを示す。
光変換された動物からの解離された腫瘍細胞のフローサイトメトリック分析は、腫瘍内CD45陽性細胞をKaede FITC陽性からKaede PE陽性に有意に変換することを明らかにし、一方でリンパ節細胞の排出は未変換のままである。CD45陽性白血球の光変換効率は腫瘍の種類と大きさの間で有意に変化し、小さな黒色腫腫瘍内のCD45陽性白血球が最も効率的な光変換を示した。腫瘍体積が増加するにつれて、変換効率は50%程度に低下し、メラニンは小さい腫瘍では約30%のメラニン産生腫瘍内で観察されたCD45陽性細胞の最大光変換で光変換効率に顕著な影響を及ぼし、腫瘍体積が400立方ミリメートルに近づくにつれて10%に低下する。
光変換の24時間後にリンパ節を排出する腫瘍の検査は、種々のフェノタイプのカエデ赤陽性免疫細胞の存在を明らかにし、したがって、光変換された腫瘍からの白血球の移動を示す。その開発後、この技術は、免疫学の分野の研究者が、末梢組織における定常状態および炎症を起こした白血球回転の運動学を明らかにする道を開いた。この手順を試みる間、周囲の組織の不注意な光変換が結果を損なうため、関心のある組織のみを光変換することが重要です。
この方法に新しい個人は、目的の白血球のダイナミクスに基づいて、組織の変換のための暴露時間だけでなく、組織の収集が発生する前の時間の持続時間を最適化する必要があります。
