マウスリンパ内皮細胞の精製

尿リンパ管内皮細胞を精製するには、マウス真皮から単離された細胞を使用して、約80〜90%のCo-fluencyに達した後、1ミリリットルの磁気ビーズコーティング溶液を使用して、事前にコード化された磁気ビーズを磁気セパレーターで洗浄することから始めます。0.1%BSAを含む150マイクロリットルのDMEMにビーズを再懸濁します。次に、60mm組織培養プレート内の細胞をPBSで2回洗浄します。

50マイクロリットルの抗体標識ビーズと0.1%BSAを含む3ミリリットルのDMEMを混合し、細胞に加えます。ディッシュをバイオフィルムで密封し、シェーカーでディッシュをインキュベートし、室温で10RPMで正確に10分間撹拌します。細胞をPBSで一度洗浄する前に、培地を廃棄してください。

細胞を迅速に検査して、プレート上のLECコロニーの存在を確認します。1ミリリットルのトリプシンEDTAを細胞に加え、摂氏37度で3分間インキュベートして細胞をトリプシン化します。細胞の剥離が成功したかどうか細胞を検査します。

2ミリリットルの完全LEC培地で溶液を中和した後。細胞溶液を5ミリリットルの滅菌ポリプロピレンチューブに移します。磁気セパレーターを使用して、0.1%BSAを含む3ミリリットルのDMEMで細胞を洗浄し、結合していない細胞を除去します。

残りのビーズ結合細胞を完全なLEC培地に再懸濁し、コラーゲンでコーティングした60mm組織培養プレートにプレートします。明視野イメージングと蛍光イメージングにより、精製後のLYVE1陽性リンパ内皮細胞を容易に同定し、それらに付着したいくつかのビーズを示しました。細胞は精製後24時間で低密度を示しましたが、精製後7日で高濃度を示しました。