Coimbra Klinik ve Biyomedikal Araştırma Enstitüsü (iCBR) ve Yenilikçi Biyotıp ve Biyoteknoloji Merkezi'nden (CIBB) Dr. Mónica Zuzarte tarafından rAAV'lerin TEM analizine ilişkin olarak sağlanan işbirliği, içgörüler ve teknik yardım için minnettarız. Coimbra Üniversitesi Sinirbilim ve Hücre Biyolojisi Merkezi'nden (CNC-UC) ve Coimbra Üniversitesi Disiplinlerarası Araştırma Enstitüsü'nden (IIIUC) Dr. Dominique Fernandes'e, birincil nöronal kültür deneylerine ilişkin paha biçilmez teknik yardımı ve içgörüleri için teşekkürlerimizi sunarız. Bu çalışma için gerekli olan pRV1, pH21 ve pFdelta6 plazmitleri, Aberdeen Üniversitesi Yaşam Bilimleri ve Tıp Fakültesi Tıp Bilimleri Fakültesi'nden Dr. Christina McClure tarafından cömertçe sağlandı ve bunun için minnettarız. Bu çalışma, Centro 2020 Bölgesel Operasyonel Programı aracılığıyla Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (ERDF) tarafından finanse edilmiştir; COMPETE 2020 - Rekabet Edebilirlik ve Uluslararasılaşma için Operasyonel Program ve FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia aracılığıyla Portekiz ulusal fonları aracılığıyla, UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020, LA/P/0058/2020, ViraVector (CENTRO-01-0145-FEDER-022095), Imagene (PTDC/BBB-NAN/0932/2014 | POCI-01-0145-FEDER-016807), ReSet - IDT-COP (CENTRO-01-0247-FEDER-070162), Sars-CoV-2 ile Mücadele (CENTRO-01-01D2-FEDER-000002), BDforMJD (CENTRO-01-0145-FEDER-181240), ModelPolyQ2.0 (CENTRO-01-0145-FEDER-181258), MJDEDIT (CENTRO-01-0145-FEDER-181266); Amerikan Portekiz Biyomedikal Araştırma Fonu (APBRF) ve Richard Chin ve Lily Lock Machado-Joseph Hastalığı Araştırma Fonu, ARDAT tarafından AB ve EFPIA tarafından desteklenen IMI2 JU Hibe anlaşması No 945473 kapsamında; GeneT- Teaming Projesi 101059981 Avrupa Birliği'nin Ufuk Avrupa programı tarafından desteklenmektedir. M.M.L. 2021.05776.BD tarafından desteklendi; C.H., 2021.06939.BD tarafından desteklendi; A.C.S. 2020.07721.BD tarafından desteklendi; ve D.D.L. 2020.09668.BD tarafından desteklenmiştir. Şekil 1 , BioRender.com kullanılarak oluşturulmuştur.

AAV Vektörlerinin Tek Adımlı Heparin Afinite Kromatografisi ile Saflaştırılması

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Hızla genişleyen AAV vektör araç seti, farklı uygulama yolları aracılığıyla çok çeşitli hücre tipleri için en umut verici gen dağıtım sistemlerinden biri haline gelmiştir. Bu çalışmada, mozaik rAAV vektörlerinin üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu için preklinik çalışmalarda değerlerini kanıtlayabilecek gelişmiş bir protokol geliştirmeyi amaçladık. Bu amaçla, rAAV1/2 ve rAAV2/9 mozaik vektörlerinin oluşturulması burada açıklanmıştır, ancak prosedür standart rAAV2 vektörlerini saflaştırmak için de uygulanabilir (veriler gösterilmemiştir).
Mozaik rAAV'ler, bir transfeksiyon reaktifi olarak PEI kullanılarak optimize edilmiş bir transfeksiyon yöntemi izlenerek üretildi. Erken evre preklinik çalışmalarda önemli avantajlar sağlayan daha fazla esnekliği ve hızı nedeniyle geçici bir transfeksiyon yöntemi seçilmiştir. Belirli bir transgen ve serotip doğrulandıktan sonra, üretim sistemi, bir enfeksiyon süreci tarafından sağlanan ek genlerle birlikte, spesifik Rep / Cap genlerinin bir alt kümesini ifade eden kararlı bir transfekte hücre hattı oluşturarak daha iyi ölçeklenebilirlik ve maliyet etkinliği elde etmek için ince ayar yapılabilir24. Kalsiyum-fosfat transfeksiyonu ile karşılaştırıldığında, PEI çeşitli avantajlar sunar. Daha geniş bir pH aralığında etkili bir şekilde çalışan stabil ve uygun maliyetli bir transfeksiyon reaktifidir. Ek olarak, transfeksiyondan sonra hücre ortamını değiştirme gereksinimini ortadan kaldırarak hem maliyette hem de iş yükünde önemli bir azalma sağlar69.
CsCl veya iyodiksanol gradyanları tarafından getirilen bazı sınırlamaları aşmak amacıyla, üretilen rAAV'ler hasat edildi ve afinite kromatografisi ile saflaştırıldı. Bu strateji, ultrasantrifüjleme ve gradyanlara ihtiyaç duymadan gerçekleştirilebilen, temiz ve yüksek viral titreler sağlayan basitleştirilmiş ve ölçeklenebilir bir yaklaşım sunar. Gerçekten de, bir FPLC sistemi kullanan kromatografi teknikleri, daha yüksek yatak yüksekliğine sahip bir kolonda daha fazla reçine hacmi paketlenerek otomatikleştirilebilir ve ölçeklendirilebilir. Burada açıklanan protokol, 5 mL HiTrap Heparin HP kolonlarını içerecek şekilde kolayca uyarlanabilir (veriler gösterilmemiştir). Ek olarak, heparin kolonları birkaç kez tekrar kullanılabilir, böylece bu yöntemin maliyet etkinliğine katkıda bulunur.
Saflaştırılmış rAAV'ler daha sonra titre, saflık, morfolojik özellikler ve biyolojik aktivite açısından karakterize edildi. İlginç bir şekilde, Coomassie mavi boyamasında, üç tipik viral kapsid proteinine ek olarak F8-F16 fraksiyonlarında yaklaşık 17 kDa'lık bir bant tespit edildi. Bununla birlikte, bu bant, rAAV'lerin konsantrasyon adımından sonra artık mevcut değildir. Ayrıca, B1 ve A69 etiketlemesi üzerine VP3'ten (<62 kDa) daha düşük moleküler ağırlığa sahip bazı soluk bantlar da tespit edilebilir, bu da bunların VP1, VP2 ve VP3 kapsid proteinlerinin70 fragmanları olabileceğini düşündürür. Başka bir olasılık da, bunların aslında ferritin veya AAV kapsid proteinleri ile benzer protein parmak izlerini paylaşan ve daha önce önerildiği gibi AAV biyolojisinde yer alabilen polipeptitlere sahip diğer hücresel proteinler gibi diğer birlikte saflaştırıcı proteinler olmasıdır 26,71,72.
TEM ve sersemletici analizi, farklı üretimlerde değişken seviyelerde boş parçacıkların varlığını da ortaya çıkardı. Benzer şekilde, daha önce yapılan diğer çalışmalar, transfeksiyon veya enfeksiyon yöntemleriyle hazırlanan rAAV'ler için değişken ve yüksek seviyelerde (%>65) boş kapsid oluştuğunu bildirmiştir24,73. rAAV üretiminin arkasındaki mekanizma, yeni sentezlenen VP proteinlerinden boş kapsidlerin hızlı oluşumu ile başlar, ardından Rep proteinlerininaracılık ettiği önceden oluşturulmuş kapsidlere genom paketlemesinin yavaş bir hız sınırlayıcı adımı ile başlar 74,75. Bu nedenle, boş ve dolu kapsidlerin oranı, ilgilenilen transgenin boyutuna ve dizisine ve hücre kültürü koşullarına bağlı olarak değişebilse de, rAAV üretimlerinde boş kapsidler üretilir58,73. Boş kapsidler, ilgilenilen genomdan yoksun oldukları için terapötik bir etki sağlayamadıkları ve ayrıca doğuştan gelen veya adaptif bir bağışıklık tepkisini potansiyel olarak artırabildikleri için bazı endişelere yol açmaktadır. Bununla birlikte, bazı raporlar, oranlarını ayarlayarak, boş AAV kapsidlerinin, AAV'ye özgü nötralize edici antikorlar için oldukça etkili tuzaklar olarak hizmet edebileceğini ve bu nedenle iletim verimlilikleriniartırabileceğini göstermiştir 60,76,77. Boş kapsidlerin varlığı kritik derecede zararlıysa ve boş parçacıkların tam vektörlere kıyasla biraz daha az anyonik karakteri göz önüne alındığında, potansiyel bir çözüm, anyon değişim kromatografisi teknikleri64 kullanılarak ikinci bir parlatma saflaştırma aşamasının yürütülmesini içerebilir.
Bu çalışma aynı zamanda, üretilen mozaik rAAV'lerin sadece in vitro nöronal kültürleri değil, aynı zamanda rAAV1/2'nin intrakraniyal enjeksiyonu üzerine CNS'yi de verimli bir şekilde dönüştürebildiğine dair ikna edici kanıtlar sunmaktadır. Genel olarak, bu sonuçlar, açıklanan üretim ve saflaştırma protokolünün, oldukça saf ve biyolojik olarak aktif rAAV'leri 6 gün içinde kullanıma hazır hale getirdiğini ve kendisini klinik öncesi çalışmalarda rAAV'lerin üretilmesi için çok yönlü ve uygun maliyetli bir yöntem olarak sunduğunu göstermektedir.

Adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörü, mevcut gen terapisi çalışmalarında en umut verici taşıyıcı sistemlerden biri olarak yolunu fethediyor. İlk olarak 1965'tetanımlanan 1 AAV, tek sarmallı bir DNA genomunu barındıran, yaklaşık 25 nm çapında bir ikosahedral protein kapsidine sahip küçük, zarfsız bir virüstür. AAV'ler, litik döngülerini tamamlamak için herpes simpleks virüsü veya daha sıklıkla adenovirüs gibi yardımcı bir virüsle ko-enfeksiyona benzersiz bağımlılıkları nedeniyle Parvoviridae ailesine ve Dependoparvovirus cinsine aittir 2,3.
AAV'lerin 4.7 kilobaz genomu, karakteristik T-şekilli firketeuçları 4 oluşturan iki ters çevrilmiş terminal tekrarı (ITR'ler) ile çevrili iki açık okuma çerçevesinden (ORF) oluşur. ITR'ler, AAV paketleme, çoğaltma ve entegrasyon için kritik olan tek cis-etkili elemanlardır, bu nedenle rekombinant AAV (rAAV) vektörlerinde tutulan tek AAV dizileridir. Bu sistemde, vektör üretimi için gerekli genler, ilgilenilen genin viral kapsid 5,6 içinde paketlenmesine izin vererek, trans halinde ayrı ayrı sağlanır.
Her viral gen, alternatif birleştirme ve başlangıç kodonları yoluyla farklı proteinleri kodlar. Rep ORF içinde, viral DNA 7,8'in replikasyonu, bölgeye özgü entegrasyonu ve kapsüllenmesinde çok önemli roller oynayan dört yapısal olmayan protein (Rep40, Rep52, Rep68 ve Rep78) kodlanmıştır. Cap ORF, N-terminallerinde (VP1, VP2 ve VP3) birbirinden farklı üç yapısal proteinin ekspresyonu için bir şablon görevi görür ve bunlar 1:1:10 4,9 oranında 60 mer'lik bir viral kapsid oluşturmak üzere bir araya gelir. Ek olarak, geleneksel olmayan bir CUG başlangıç kodonu ile Cap geninde iç içe geçmiş alternatif bir ORF, bir montaj aktive edici proteini (AAP) kodlar. Bu nükleer proteinin yeni sentezlenen kapsid proteinleri VP1-3 ile etkileşime girdiği ve kapsid montajını teşvik ettiğigösterilmiştir 10,11.
Kapsidin amino asit dizisindeki farklılıklar, doğal olarak oluşan 11 AAV serotipini ve insanlardan ve insan olmayan primat dokularından izole edilen 100'den fazla varyantı açıklar 7,12,13. Yapısal olarak değişken bölgelerin konformasyonundaki varyasyonlar, farklı suşlardan kapsidlerin farklı antijenik özelliklerini ve reseptör bağlama özgüllüklerini yönetir. Bu, farklı memeli organları arasında farklı doku tropizmleri ve transdüksiyon verimlilikleri ile sonuçlanır14.
rAAV'lerin erken üretim yöntemleri, yardımcı amaçlar için adenovirüs enfeksiyonuna dayanıyordu 15,16,17,18,19. Verimli olmasına ve genellikle büyük ölçekte üretilmesi kolay olmasına rağmen, bu enfeksiyondan çeşitli problemler ortaya çıkar. Saflaştırma ve inaktivasyon için ısıyla denatüre edici bir adımdan sonra bile, adenoviral partiküller AAV preparatlarında hala mevcut olabilir ve bu da istenmeyen bir güvenlik sorunu oluşturur20. Ayrıca, denatüre adenoviral proteinlerin varlığı klinik kullanım için kabul edilemez. Diğer üretim stratejileri, Rep / Cap ve transgeni hedef hücrelere21 veya bakulovirüs-böcek hücre sistemine22 getirmek için tasarlanmış rekombinant herpes simpleks virüs suşlarından yararlanır. Bu sistemler ölçeklenebilirlik ve GMP uyumluluğu açısından avantajlar sunsa da yine de benzer sorunlarla karşı karşıyadır.
rAAV üretimi için üçlü transfeksiyon yöntemi, bu sorunların kolayca üstesinden gelmek için yaygın olarak benimsenmiştir. Kısaca, rAAV düzeneği, aşağıdakileri kodlayan üç plazmid ile hücrelerin geçici transfeksiyonuna dayanır: 1) vahşi tip AAV2 genomundan (pITR) ITR'ler arasında paketlenmiş transgen ekspresyon kaseti; 2) replikasyon ve virion montajı (pAAV-RC) için gerekli Rep / Cap dizileri; ve 3) minimal adenoviral proteinler (E1A, E1B, E4 ve E2A) ile birlikte yardımcı etki için gerekli olan adenovirüs virüsü ile ilişkili RNA'lar (pHelper)6,20,23. Plazmid transfeksiyon yöntemleri, klinik öncesi çalışmalarda rAAV üretimi için basitlik ve esneklik sağlarken, bu prosedürlerin büyük ölçekli üretime uygulandığında ölçeklenebilirlik ve tekrarlanabilirlik açısından sınırlamaları vardır. Alternatif bir yaklaşım olarak, rAAV üretimi, vektör yapılarıyla kombinasyon halinde AAV Rep / Cap genlerini veya Rep / Cap'i kararlı bir şekilde ifade eden AAV üretici hücre hatlarının (hem yapışık hem de süspansiyon büyümesinin) kullanılması yoluyla elde edilebilir. Bu sistemlerde, adenoviral yardımcı genler plazmit transfeksiyonu yoluyla tanıtılır. Bu strateji, hücre kültürü sürecinin ölçeklenebilirliğini geliştirse de, teknik olarak karmaşık ve zaman alıcıdır 21,24,25.
Her iki durumda da, üretici hücreler daha sonra parçalanır ve bir veya daha fazla saflaştırma aşamasına tabi tutulur. Şu anda, rAAV'leri saflaştırmak için temel yöntemler, sezyum klorür (CsCl) veya iyodiksanol ultra yüksek hızlı yoğunluklu gradyan santrifüjlemesinin kullanımını ve ardından kromatografi teknikleri ile takip edilip edilmediğini içermektedir26. Viral çökeltme için orijinal saflaştırma şeması, amonyum sülfat kullandı, ardından bir CsCl gradyanı boyunca iki veya üç tur ultrasantrifüjleme yapıldı. Bu işlemin ana avantajları, tüm serotiplerin saflaştırılması ve farklı yoğunluklarına göre dolu partikülleri boş kapsidlerden fiziksel olarak ayırma yeteneğini içerir. Bununla birlikte, bu yöntem ayrıntılı, zaman alıcıdır ve sınırlı ölçeklenebilirliğe sahiptir, bu da genellikle düşük verim ve düşük numune kalitesi ile sonuçlanır 27,28,29,30. Ayrıca, CsCl'nin memeliler üzerinde uygulayabileceği toksik etkiler nedeniyle in vivo çalışmalardan önce fizyolojik bir tampona karşı diyaliz sıklıkla gereklidir.
İodiksanol, rAAV vektörlerini saflaştırmak için alternatif bir izo-ozmotik gradyan ortamı olarak da kullanılmıştır ve hem güvenlik hem de vektör gücü açısından CsCl'ye göre avantajları vardır. Bununla birlikte, CsCl gibi, iyodiksanol yöntemi de hücre kültürü lizatının yükleme kapasitesi (ve dolayısıyla rAAV saflaştırmasının ölçeklenebilirliği) ile ilgili bazı dezavantajlar sunar ve zaman alıcı ve pahalı bir yöntem olmaya devam etmektedir30,31.
Bu kısıtlamaların üstesinden gelmek için araştırmacılar dikkatlerini kromatografi tekniklerine çevirdiler. Bu bağlamda, afinite, hidrofobik veya iyon değişim kromatografisi yöntemlerini içeren çeşitli saflaştırma yaklaşımları geliştirilmiştir. Bu yöntemler, doğal reseptörleri de dahil olmak üzere belirli bir serotipin biyokimyasal özelliklerine veya viral partikülün32 yük özelliklerine dayanır. Örneğin, AAV2, AAV3, AAV6 ve AAV13'ün tercihen heparan sülfat proteoglikanlarına (HSPG) bağlandığının keşfi, afinite kromatografisi saflaştırmasında yakından ilişkili heparinin kullanılması olasılığını ortaya çıkardı. Bununla birlikte, HSPG'ye bağlanma bölgeleri serotipler arasında farklılık gösterebilir, AAV bağlanmasına ve hedef hücrelerin farklı şekillerde enfeksiyonuna aracılık eder 2,33,34,35,36. Öte yandan, AAV1, AAV5 ve AAV6, N-bağlı sialik aside (SA) bağlanırken, AAV4, O-bağlı SA 2,14,34'ü kullanır. Aynı mantığı takiben, SA37 açısından yüksek oranda zenginleştirilmiş bir memeli proteini olan müsinin kullanımına dayalı olarak rAAV5'in saflaştırılması için tek aşamalı bir afinite kromatografi protokolü de geliştirilmiştir. Heparin bazlı teknikler gibi, bu saflaştırma da üretilen spesifik serotipe bağlıdır. Heparin ve müsin dışında, A20 monoklonal antikoru ve deve tek alanlı antikorlar (AVB Sepharose ve POROS CaptureSelect) gibi afinite kromatografisi için başka ligandlar da araştırılmıştır22,23,38,39,40,41. Daha önce var olan saflaştırma yöntemlerini geliştirmeye yönelik diğer yenilikçi stratejiler, spesifik bağlanma epitoplarını sunmak için rAAV kapsidinde küçük modifikasyonların uygulanmasını içerir. Örneğin, heksa-histidin etiketli veya biyotinile rAAV'ler, bu epitopları (sırasıyla nikel nitrilotriasetik asit ve avidin reçineleri) hedefleyen ligandlar kullanılarak saflaştırılabilir42,43,44.
rAAV'lerin istenen özelliklerini genişletme çabasıyla, araştırmacılar kapsidlerini karıştırarak viryonları çapraz giydirdiler. Bu, kapsid geninin üretim sırasında eşmolar veya farklı oranlarda iki farklı AAV serotipinden sağlanmasıyla gerçekleştirilir ve farklı serotiplerden 34,45,46,47,48,49,50 kapsid alt birimlerinin bir karışımından oluşan bir kapsid yapısına yol açar . Önceki çalışmalar, AAV2'den AAV1 (1:1 oranı) ve AAV2'den AAV9 (1:1 oranı) ile birlikte eksprese edilen kapsid proteinlerinin, sırasıyla mozaik rAAV1/2 ve rAAV2/9 vektörlerinin üretilmesine yol açtığına dair fiziksel kanıtlar sunmaktadır 45,46,48. Mozaik rAAV'lerin üretilmesinin önemli bir yararı, rAAV üretimi sırasında yararlı olan diğer özellikleri korurken, transgen ekspresyonu ve tropizmde sinerjik iyileşmeler ile sonuçlanan, farklı AAV serotiplerinden avantajlı özellikleri entegre etme kapasitesidir. İlginç bir şekilde, bazı mozaik varyantları, her iki ebeveyn virüsünden farklı yeni özellikler bile sergiler 46,47,49. AAV2'nin heparin bağlama yeteneğinden yararlanarak, mozaik rAAV vektörleri, AAV2'nin yönlendirilmiş evrim ve/veya rasyonel tasarım tarafından üretilen diğer doğal veya yeni AAV kapsidleri ile karıştırılmasıyla potansiyel olarak üretilebilir ve saflaştırılabilir. Bununla birlikte, önceki çalışmalar, mozaik vektörlerini birleştirmeye çalışırken kapsid alt birim uyumluluğunun önemini vurgulamıştır. Örneğin, Rabinowitz ve meslektaşları, AAV1, AAV2 ve AAV3'ün transkapsidasyonunun mozaik kapsidlerin verimli bir şekilde birlikte birleştirilmesine yol açmasına rağmen, bu serotiplerin AAV4 ile çapraz giyinmesinin kararlı virionların oluşumunu engellediğini gösterdi 34,45,47. Ek olarak, AAV1, AAV2 ve AAV3, bu kapsidleri farklı oranlarda karıştırırken elde edilen azalmış viral titreler göz önüne alındığında, AAV5 ile düşük uyumluluk gösterdi. İlginç bir şekilde, mozaik rAAV2/5, ebeveyn AAV5 gibi müsin bağlama yeteneğini korurken, heparin bağlama özelliklerinin azaldığını gösterdi. Bununla birlikte, 3: 1 oranında rAAV3 / 5, heparin ve müsine ikili bağlanmayı korumuştur. Genel olarak, gelişmiş transdüksiyon, spesifik tropizm veya düşük immünojenisiteye sahip yeni mozaik rAAV'lerin üretilmesi, kapsid montajı ve reseptör etkileşimleri hakkındaki anlayışımızdan büyük ölçüde yararlanabilir ve spesifik kombinasyonlar hala kapsamlı araştırma ve optimizasyon gerektirir.
Bu çalışmada, optimize edilmiş bir heparin afinite kromatografisi yöntemi kullanarak rAAV'lerin üretimi ve saflaştırılması için adım adım bir protokol açıklanmaktadır. rAAV'ler geçici transfeksiyon ile üretilir ve hızlı bir protein sıvı kromatografisi (FPLC) sistemi kullanılarak saflaştırılır. Seçilen saflaştırılmış fraksiyonların konsantrasyonundan sonra, elde edilen viral stoklar, in vitro ve in vivo olarak titre, saflık, içsel fiziksel özellikler ve biyolojik aktivite açısından karakterize edilir. Kavramın bir kanıtı olarak, mozaik rAAV1/2 ve rAAV2/9 vektörlerinin oluşturulması için bu protokolün iyileştirmelerini ve uygulanabilirliğini gösteriyoruz. Her bir serotipin seçimi, çarpıcı bir şekilde farklı tropizmlerine dayanıyordu ve potansiyel olarak benzersiz özelliklerini mozaik versiyonlara da kazandırıyordu. Merkezi sinir sistemi (CNS) için genel olarak ılımlı bir tropizme sahip AAV serotip 1, nöronları ve gliaları (daha az ölçüde) dönüştürme yeteneğine sahiptir ve in vivo 2,7,8 anterograd ve retrograd yönlerde aksonal taşımaya uğrar. Ek olarak, AAV serotip 9, hem yenidoğan hem de yetişkin farelerde kan-beyin bariyerini geçme ve CNS'yi hedefleme konusundaki doğal yeteneği nedeniyle seçilmiştir 51,52. Son olarak, afinite kromatografisine33 izin veren heparine bağlanma yeteneği göz önüne alındığında AAV serotip 2 seçildi. Saflaştırılmış rAAV1/2 ve rAAV2/9 partikülleri, her iki ebeveyn AAV serotipinin özelliklerini birleştirir ve bu nedenle CNS 45,46,48,49'un transdüksiyonu için uygun vektörler oluşturur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% povidone-iodine</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS093943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11889684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8217;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Stunner plate</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>701-2025</td>
			<td>96-well quantification plate for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAVpro Titration Kit (for Real-Time PCR) Ver.2</td>
			<td>Takara</td>
			<td>6233</td>
			<td>For determining the titer of AAV using RT-qPCR. This kit contains DNase I, Lysis Buffer, Dilution Buffer, positive control, Taq II mix, primer forward, primer reverse, water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid glacial</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A/0360/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA pure 25</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29018224</td>
			<td>FPLC system controlled by UNICORN software, version 6.3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase-linked goat anti-mouse</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra-0.5 centrifugal filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC5100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra-15 centrifugal filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase Nuclease</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Real-Time PCR detection system</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>184-5096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Touch Imaging System</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>1708370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken polyclonal anti-GFP primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Blue G250</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C/P541/46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP17225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECF Substrate for Western Blotting</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>RPN5785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest SmaI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>FD0663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEI-Tecnai G2 Spirit Biotwin</td>
			<td>FEI</td>
			<td>Biotwin</td>
			<td>Transmission electron microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence mounting medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar-carbon coated 200 mesh grid</td>
			<td>&#160;TAAB Laboratories Equipment</td>
			<td>F077/025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas evacuation apparatus</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R546W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>10021083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-chicken antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton needle 30G, Small Hub RN Needle, 25 mm, PST3</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (10 &#181;L)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7653-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Heparin HP 1 x 5 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17040701</td>
			<td>Pre-packed heparin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17040601</td>
			<td>Pre-packed heparin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF Membrane</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Braun</td>
			<td>469860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine&#160;</td>
			<td>Dechra Pharmaceuticals</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Nimatek</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-retention microcentrifuge tubes (2 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11906965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lunatic &#38; Stunner Client software</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Client analysis software version 8.0.1.235. Software for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M/4000/FP21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2 antibody (A69)</td>
			<td>American Research Products</td>
			<td>03-61057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2, VP3 antibody (B1)</td>
			<td>American Research Products</td>
			<td>03-61058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuro2a</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CCL-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>12738422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NZYColour Protein Marker II</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td>MB09002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-CMV-scGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>32396</td>
			<td>Addgene plasmid # 32396; http://n2t.net/addgene:32396; RRID:Addgene_32396</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-CMV-ssGFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>105530</td>
			<td>Addgene plasmid # 105530; http://n2t.net/addgene:105530; RRID:Addgene_105530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV2/9n</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112865</td>
			<td>Addgene plasmid # 112865; http://n2t.net/addgene:112865; RRID:Addgene_112865</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>10342243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP2438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24040032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine MAX, MW 40,000</td>
			<td>Polysciences Europe</td>
			<td>24765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R500 Series Compact Small Animal Anesthesia Machine - Isoflurane</td>
			<td>RWD</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Inlet Valve V9-IS</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29027746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample pump P9-S</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29027745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10428420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PVDF syringe filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15191499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stunner Platform</td>
			<td>Unchained Labs</td>
			<td>700-2002</td>
			<td>Equipment for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superloop 150 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>18-1023-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superloop 50 mL</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>18-1113-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURE 2 supercompetent cells</td>
			<td>Stratagene, Agilent Technologies</td>
			<td>HPA200152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treated culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>734-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin (WGA) conjugated with Alexa Fluor 633</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>W21404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Dechra Pharmaceuticals</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sedaxylan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Observer Z1</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope equiped with an EC Plan-Neofluar 10x/0.30 objective and a Plan-Apochromat 40x/0.95 objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Scan.Z1</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Slide scanner fluorescence microscope equipped with a Plan-Apochromat 20x/0.8 objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 710</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Inverted confocal microscope equipped with a Plan-Apochromat 40x/1.4 Oil DIC objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 well Ibidi</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>8-well chamber slide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adeno-associated viral vectors through a single-step and semi-automated heparin affinity chromatography protocol

Adeno-ilişkili virüs (AAV), in vivo gen iletimi için giderek daha değerli bir vektör haline gelmiştir ve şu anda insan klinik denemelerinden geçmektedir. Bununla birlikte, AAV'leri saflaştırmak için yaygın olarak kullanılan yöntemler, sezyum klorür veya iyodiksanol yoğunluk gradyan ultrasantrifüjlemeyi kullanır. Avantajlarına rağmen, bu yöntemler zaman alıcıdır, sınırlı ölçeklenebilirliğe sahiptir ve genellikle düşük saflıkta vektörlerle sonuçlanır. Bu kısıtlamaların üstesinden gelmek için araştırmacılar dikkatlerini kromatografi tekniklerine çeviriyorlar. Burada, AAV'lerin saflaştırılması için evrensel bir yakalama adımı olarak hizmet eden optimize edilmiş bir heparin bazlı afinite kromatografisi protokolü sunuyoruz.
Bu yöntem, heparan sülfat proteoglikanları için AAV serotip 2'nin (AAV2) içsel afinitesine dayanır. Spesifik olarak, protokol, istenen AAV kapsid proteinlerini AAV2'ninkilerle kodlayan plazmitlerin birlikte transfeksiyonunu gerektirir ve her iki ebeveyn serotipinin özelliklerini birleştiren mozaik AAV vektörleri verir. Kısaca üretici hücrelerin parçalanmasından sonra, AAV partikülleri içeren bir karışım, standart bir hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) sistemi kullanılarak optimize edilmiş tek aşamalı heparin afinite kromatografisi protokolünü takiben doğrudan saflaştırılır. Saflaştırılmış AAV partikülleri daha sonra konsantre edilir ve saflık ve biyolojik aktivite açısından kapsamlı karakterizasyona tabi tutulur. Bu protokol, ultrasantrifüjleme ve gradyanlara ihtiyaç duymadan gerçekleştirilebilen, temiz ve yüksek viral titreler sağlayan basitleştirilmiş ve ölçeklenebilir bir yaklaşım sunar.

Adeno-associated virus (AAV) vector is conquering its way as one of the most promising delivery systems in current gene therapy studies. Initially identified in 19651, AAV is a small, non-enveloped virus, with an icosahedral protein capsid of about 25 nm in diameter, harboring a single-stranded DNA genome. AAVs belong to the Parvoviridae family and to the Dependoparvovirus genus owing to their unique dependence on co-infection with a helper virus, such as herpes simplex virus or, more frequently, adenovirus, to complete their lytic cycle2,3.
The 4.7 kilobase genome of AAVs consists of two open reading frames (ORFs) flanked by two inverted terminal repeats (ITRs) that form characteristic T-shaped hairpin ends4. ITRs are the only cis-acting elements critical for AAV packaging, replication, and integration, therefore being the only AAV sequences retained in recombinant AAV (rAAV) vectors. In this system, the genes necessary for vector production are supplied separately, in trans, allowing the gene of interest to be packaged inside the viral capsid5,6.
Each viral gene codifies different proteins through alternative splicing and start codons. Within the Rep ORF, four non-structural proteins (Rep40, Rep52, Rep68, and Rep78) are encoded, playing crucial roles in replication, site-specific integration, and encapsidation of viral DNA7,8. The Cap ORF serves as a template for the expression of three structural proteins differing from each other at their N-terminus, (VP1, VP2, and VP3), that assemble to form a 60-mer viral capsid at a ratio of 1:1:104,9. Additionally, an alternative ORF nested in the Cap gene with a nonconventional CUG start codon encodes an assembly-activating protein (AAP). This nuclear protein has been shown to interact with the newly synthesized capsid proteins VP1-3 and promote capsid assembly10,11.
Differences in the amino acid sequence of the capsid account for the 11 naturally occurring AAV serotypes and over 100 variants isolated from humans and non-human primate tissues7,12,13. Variations in the conformation of structurally variable regions govern the distinct antigenic properties and receptor-binding specificities of capsids from different strains. This results in distinct tissue tropisms and transduction efficiencies across different mammalian organs14.
Early production methods of rAAVs relied on adenovirus infection for helper purposes15,16,17,18,19. Despite being efficient and usually easy to produce on a large scale, several problems arise from this infection. Even after the purification and a heat-denaturing step for inactivation, adenoviral particles may still be present in AAV preparations, constituting an unwanted safety issue20. Moreover, the presence of denatured adenoviral proteins is unacceptable for clinical use. Other production strategies take advantage of recombinant herpes simplex virus strains engineered to bring the Rep/Cap and transgene into the target cells21 or of the baculovirus-insect cell system22. Although these systems offer advantages in terms of scalability and GMP compatibility, they still face similar problems.
The triple transfection method for rAAV production has been commonly adopted to easily overcome these issues. Briefly, the rAAV assembly relies on the transient transfection of cells with three plasmids encoding for: 1) the transgene expression cassette packed between the ITRs from the wild-type AAV2 genome (pITR); 2) the Rep/Cap sequences necessary for replication and virion assembly (pAAV-RC); and 3) the minimal adenoviral proteins (E1A, E1B, E4, and E2A) along with the adenovirus virus-associated RNAs required for the helper effect (pHelper)6,20,23. While plasmid transfection methods provide simplicity and flexibility for rAAV production in preclinical studies, these procedures have limitations in terms of scalability and reproducibility when applied to large-scale production. As an alternative approach, rAAV production can be achieved through the use of AAV producer cell lines (of both adherent and suspension growth), stably expressing either AAV Rep/Cap genes or Rep/Cap in combination with vector constructs. In these systems, the adenoviral helper genes are introduced through plasmid transfection. Even though this strategy improves the scalability of the cell culture process, it is technically complex and time-consuming21,24,25.
In either case, the producer cells are then lysed and subjected to one or multiple purification steps. Currently, the principal methods for purifying rAAVs include the use of cesium chloride (CsCl) or iodixanol ultra-high speed density gradient centrifugation followed, or not, by chromatography techniques26. The original purification scheme for viral precipitation used ammonium sulfate, followed by two or three rounds of ultracentrifugation through a CsCl gradient. The main advantages of this process include the possibility to purify all serotypes and the ability to physically separate full particles from empty capsids based on their different densities. This method, however, is elaborate, time-consuming, and has limited scalability, often resulting in poor yield and low sample quality27,28,29,30. Moreover, dialysis against a physiological buffer is often necessary before in vivo studies due to the toxic effects that CsCl can exert on mammals.
Iodixanol has also been used as an alternative iso-osmotic gradient medium to purify rAAV vectors, with advantages over CsCl from both safety and vector potency points of view. However, like CsCl, the iodixanol method presents some drawbacks related to the loading capacity of cell culture lysate (and thus the scalability of rAAV purification) and it remains a time-consuming and expensive method30,31.
To overcome these constraints, researchers turned their attention to chromatography techniques. In this regard, several purification approaches were developed that either incorporate affinity, hydrophobic, or ion-exchange chromatography methods. These methods rely on the biochemical properties of a particular serotype, including their natural receptors, or the charge characteristics of the viral particle32. For instance, the discovery that AAV2, AAV3, AAV6, and AAV13 preferably bind to heparan sulfate proteoglycans (HSPG), opened the possibility of using the closely related heparin in affinity chromatography purification. However, the binding sites to HSPG can differ among serotypes, mediating AAV attachment and infection of target cells in different ways2,33,34,35,36. On the other hand, AAV1, AAV5, and AAV6 bind to N-linked sialic acid (SA), while AAV4 uses O-linked SA2,14,34. Following the same rationale, a single-step affinity chromatography protocol for the purification of rAAV5 has also been developed based on the use of mucin, a mammalian protein highly enriched in SA37. Like heparin-based techniques, this purification is also dependent on the specific serotype being generated. Apart from heparin and mucin, other ligands have been explored for affinity chromatography, such as the A20 monoclonal antibody and camelid single-domain antibodies (AVB Sepharose and POROS CaptureSelect)22,23,38,39,40,41. Other innovative strategies to improve the previously existing purification methods involve the introduction of small modifications in the rAAV capsid to present specific binding epitopes. For instance, hexa-histidine-tagged or biotinylated rAAVs can be purified using ligands that target those epitopes (nickel nitrilotriacetic acid and avidin resins, respectively)42,43,44.
In an effort to broaden the desired characteristics of rAAVs, investigators have cross-dressed the virions by mixing their capsids. This is accomplished by supplying the capsid gene from two distinct AAV serotypes in equimolar or different ratios during production, giving rise to a capsid structure composed of a mixture of capsid subunits from different serotypes34,45,46,47,48,49,50. Previous studies provide physical evidence that co-expressing capsid proteins from AAV2 with AAV1 (1:1 ratio) and AAV2 with AAV9 (1:1 ratio) results in the generation of mosaic rAAV1/2 and rAAV2/9 vectors, respectively45,46,48. A major benefit of the generation of mosaic rAAVs is the capacity to integrate advantageous traits from different AAV serotypes, resulting in synergistic improvements in transgene expression and tropism, while maintaining other properties useful during rAAV production. Interestingly, certain mosaic variants even exhibit novel properties different from either parental virus46,47,49. By taking advantage of the heparin-binding ability of AAV2, mosaic rAAV vectors could potentially be generated and purified by mixing AAV2 with other natural or new AAV capsids generated by directed evolution and/or rational design. Nonetheless, previous studies have highlighted the importance of capsid subunit compatibility when attempting to assemble mosaic vectors. For instance, Rabinowitz and colleagues demonstrated that although the transcapsidation of AAV1, AAV2, and AAV3 led to an efficient co-assembly of mosaic capsids, the cross-dressing of these serotypes with AAV4 hindered the generation of stable virions34,45,47. Additionally, AAV1, AAV2, and AAV3 showed low compatibility with AAV5, given the reduced viral titers obtained when mixing these capsids at different ratios. Interestingly, mosaic rAAV2/5 showed decreased heparin-binding properties, while maintaining mucin-binding ability like parental AAV5. However, rAAV3/5 at a 3:1 ratio preserved the dual binding to heparin and mucin. Overall, the generation of new mosaic rAAVs with enhanced transduction, specific tropism, or low immunogenicity could greatly benefit from our understanding of capsid assembly and receptor interactions, with specific combinations still requiring thorough investigation and optimization.
In the present work, we describe a step-by-step protocol for the production and purification of rAAVs using an optimized heparin affinity chromatography method. rAAVs are produced by transient transfection and are purified using a fast protein liquid chromatography (FPLC) system. After the concentration of selected purified fractions, the resulting viral stocks are characterized in terms of titer, purity, intrinsic physical properties, and biological activity in vitro and in vivo. As a proof of concept, we demonstrate the improvements and applicability of this protocol for the generation of mosaic rAAV1/2 and rAAV2/9 vectors. The choice of each serotype was based on their strikingly different tropisms, potentially conferring their unique characteristics to the mosaic versions as well. AAV serotype 1, with an overall moderate tropism for the central nervous system (CNS), has the ability to transduce neurons and glia (to a lesser extent) and undergoes axonal transport in the anterograde and retrograde directions in vivo2,7,8. Additionally, AAV serotype 9 was chosen for its natural ability to cross the blood-brain barrier and target the CNS in both neonatal and adult mice51,52. Finally, AAV serotype 2 was selected given its ability to bind to heparin, allowing affinity chromatography33. The purified rAAV1/2 and rAAV2/9 particles combine the properties of both parental AAV serotypes and, therefore, constitute suitable vectors for the transduction of the CNS45,46,48,49.

Yazar Spotlight: Adeno İlişkili Viral Vektörlerin Üretimi ve Saflaştırılması için Geliştirilmiş Yöntem

Adeno ile İlişkili Viral Vektörlerin Tek Adımlı ve Yarı Otomatik Heparin Afinite Kromatografisi Protokolü ile İzolasyonu

In this work, we intend to develop an improved protocol for the production, purification, and characterization of mosaic adeno-associated viral vectors that could prove their worth in preclinical studies. Despite efforts to establish stable producer cell lines, transient transfection in mammalian cells is still the predominant workflow for AAV production. Then the AAVs are purified by ultra-high speed density gradient centrifugation, or by chromatography techniques that rely on the biochemical properties of viral particles.The commonly used methods to purify AAVs make use of cesium chloride, or iodixanol density gradient ultracentrifugation. Despite their advantages, they have some limitations. They are time-consuming, they have limited scalability, and they are often giving results to some vectors with low purity.Now, to overcome these constraints, several researchers have turned their attention to chromatography techniques. We describe a step-by-step protocol for the generation of mosaic rAAVs based on the heparin-binding ability of AAV2. This method renders highly pure and biologically active rAAVs ready to use in six days, presenting itself as a semi-automated, scalable, and cost-effective strategy to generate rAAVs for preclinical studies.Having demonstrated the applicability of this method for the generation of mosaic rAAVs, the production system can now be fine-tuned to achieve a better scalability and cost effectiveness by establishing a producer cell line. Additionally, we aim to remove empty particles by including a second polishing purification step.

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Improved Method for Production and Purification of Adeno-Associated Viral Vectors at JoVE.com

Bu el yazması, optimize edilmiş bir heparin bazlı afinite kromatografisi yöntemi kullanılarak adeno ile ilişkili viral vektörlerin üretilmesi ve saflaştırılması için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Ultrasantrifüjleme ihtiyacını ortadan kaldıran basit, ölçeklenebilir ve uygun maliyetli bir yaklaşım sunar. Elde edilen vektörler, klinik öncesi çalışmalarda değerlerini kanıtlayan yüksek saflık ve biyolojik aktivite sergiler.

Adeno-associated virus (AAV) has become an increasingly valuable vector for in vivo gene delivery and is currently undergoing human clinical trials. ...

Bu çalışmada, mozaik adeno ile ilişkili viral vektörlerin üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu için klinik öncesi çalışmalarda değerlerini kanıtlayabilecek gelişmiş bir protokol geliştirmeyi amaçlıyoruz. İstikrarlı üretici hücre hatları oluşturma çabalarına rağmen, memeli hücrelerinde geçici transfeksiyon, AAV üretimi için hala baskın iş akışıdır. Daha sonra AAV'ler, ultra yüksek hızlı yoğunluklu gradyan santrifüjleme veya viral partiküllerin biyokimyasal özelliklerine dayanan kromatografi teknikleri ile saflaştırılır.AAV'leri saflaştırmak için yaygın olarak kullanılan yöntemler, sezyum klorür veya iyodiksanol yoğunluk gradyan ultrasantrifüjlemesi kullanır. Avantajlarına rağmen, bazı sınırlamaları vardır. Zaman alıcıdırlar, sınırlı ölçeklenebilirliğe sahiptirler ve genellikle bazı vektörlere düşük saflıkta sonuç verirler.Şimdi, bu kısıtlamaların üstesinden gelmek için, birkaç araştırmacı dikkatlerini kromatografi tekniklerine çevirdi. AAV2'nin heparin bağlama yeteneğine dayalı olarak mozaik rAAV'lerin üretilmesi için adım adım bir protokol açıklıyoruz. Bu yöntem, son derece saf ve biyolojik olarak aktif rAAV'leri altı gün içinde kullanıma hazır hale getirir ve kendisini klinik öncesi çalışmalar için rAAV'ler oluşturmak için yarı otomatik, ölçeklenebilir ve uygun maliyetli bir strateji olarak sunar.Mozaik rAAV'lerin üretimi için bu yöntemin uygulanabilirliğini gösterdikten sonra, üretim sistemi artık bir üretici hücre hattı kurarak daha iyi bir ölçeklenebilirlik ve maliyet etkinliği elde etmek için ince ayar yapılabilir. Ek olarak, ikinci bir parlatma saflaştırma adımı ekleyerek boş parçacıkları gidermeyi amaçlıyoruz.

isolation-adeno-associated-viral-vectors-through-single-step-semi

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Isolation of Adeno-Associated Viral Vectors Through a Single-Step and Semi-Automated Heparin Affinity Chromatography Protocol

1.6K Görüntüleme.  University of Coimbra. Bu çalışmada, mozaik adeno ile ilişkili viral vektörlerin üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu için klinik öncesi çalışmalarda değerlerini kanıtlayabilecek gelişmiş bir protokol geliştirmeyi amaçlıyoruz. İstikrarlı üretici hücre hatları oluşturma çabalarına rağmen, memeli hücrelerinde geçici transfeksiyon, AAV üretimi için hala baskın iş akışıdır. Daha sonra AAV'ler, ultra yüksek hızlı yoğunluklu gradyan santrifüjleme veya viral partiküll...