Isolamento de vetores virais adeno-associados por meio de um protocolo de cromatografia de afinidade de heparina de etapa única e semiautomatizada

Neste trabalho, pretendemos desenvolver um protocolo aprimorado para a produção, purificação e caracterização de vetores virais adeno-associados em mosaico que possam provar seu valor em estudos pré-clínicos. Apesar dos esforços para estabelecer linhagens celulares produtoras estáveis, a transfecção transitória em células de mamíferos ainda é o fluxo de trabalho predominante para a produção de AAV. Em seguida, os AAVs são purificados por centrifugação com gradiente de densidade de velocidade ultra-alta ou por técnicas de cromatografia que dependem das propriedades bioquímicas das partículas virais.

Os métodos comumente usados para purificar AAVs fazem uso de cloreto de césio ou ultracentrifugação de gradiente de densidade de iodixanol. Apesar de suas vantagens, eles têm algumas limitações. Eles são demorados, têm escalabilidade limitada e geralmente dão resultados a alguns vetores com baixa pureza.

Agora, para superar essas restrições, vários pesquisadores voltaram sua atenção para as técnicas de cromatografia. Descrevemos um protocolo passo a passo para a geração de rAAVs em mosaico com base na capacidade de ligação à heparina do AAV2. Este método torna rAAVs altamente puros e biologicamente ativos prontos para uso em seis dias, apresentando-se como uma estratégia semiautomatizada, escalável e econômica para gerar rAAVs para estudos pré-clínicos.

Tendo demonstrado a aplicabilidade deste método para a geração de rAAVs em mosaico, o sistema de produção pode agora ser ajustado para obter uma melhor escalabilidade e custo-benefício através do estabelecimento de uma linhagem celular produtora. Além disso, pretendemos remover partículas vazias, incluindo uma segunda etapa de purificação de polimento.