ブタ島精製のための連続勾配法

まず、ポンプを毎分200ミリリットルの流量に設定し、125ミリリットルの高密度グラジエント溶液を連続グラジエントフォーマーにロードし、次にセルプロセッサにロードします。セルプロセッサの遠心分離機能を 1 、 000 RPM で開始します。システムから空気を放出し、高密度グラジエント溶液で再剥離します。

次に、125ミリリットルの高密度グラジエント溶液と130ミリリットルの低密度溶液をグラジエントフォーマーに加えます。消化した組織懸濁液を100ミリリットルロードします。セルプロセッサの速度を 2, 000 RPM に 3 分間上げます。

精製された膵島画分を収集するための16本の50ミリリットルの円錐管を準備するには、各チューブに25ミリリットルのRPMI培地を追加し、昇順で配置します。精製した膵島画分を準備した円錐形チューブに集めます。膵島を染色するには、精製した各膵島画分から100〜200マイクロリットルのアリコートを収集し、24ウェル組織培養プレートでDTZ染色を使用して膵島含有量を評価します。

4Xの光学顕微鏡を使用して、小島が暗赤色から黒く見える各画分を検査します。このプロトコルを使用して、膵島分離を3匹のブタに対して行った。明視野画像は精製された膵島を示し、生/死染色を使用して生存率について特徴付けました。

膵島分離後の代表的な膵島サイズ分布は、約50〜100ミクロンのサイズ分布を示しました。さらに、収量と純度を膵島細胞カウンターを用いて評価し、効率的なブタ膵臓単離を示しました。