まず、マウスの骨髄細胞をHoechst 33342で染色します。フローサイトメトリーの場合は、必要なソフトウェアを起動し、QC標準化を選択します。品質管理またはQC FluoroSphereサンプルチューブをチューブホルダーに挿入してから、QC手順を開始するための開始を選択します。
新しい実験を作成するには、[ファイル] メニューの [新しい実験] をクリックし、ファイル パスを指定して実験を保存します。次に、[設定]メニューの[チャネルの設定]を選択します。チャンネル信号のチェックボックスを選択し、ラベル列に試薬名を追加します。
次に、プロット領域の疑似カラープロットアイコンをクリックして、プロットを作成します。試験管画面で「チューブを追加」をクリックすると、新しいサンプルチューブが作成され、名前が変更されます。次に、[実行] を選択してサンプルを読み込み、プロットを表示し、ゲートを確立します。
ゲインとスレッショルドの設定を調整し、[レコード]を選択してデータを保存します。ゲート設定ロジックを設計するには、x 軸をクリックして FSEW を選択し、y 軸をクリックして FSEA を選択します。[ポリゴン ゲート] を選択して、ゲート A を描画し、個々のセルを円で囲み、接着セルを除外します。
2番目のプロットでは、x軸をクリックしてFSEAを選択し、y軸をクリックしてSSEAを選択します。[ポリゴンゲート]を選択してゲートBを描画し、非断片的な細胞を分離し、細胞の破片を除外します。3番目のプロットでは、X軸をクリックしてPIAを選択し、Y軸をクリックしてSSEAを選択します。
ゲートBを描画した後、陰性のヨウ化プロピジウムを示す生細胞を選択し、ゲートCを描画して生細胞を取得します。4番目の2次元プロットでは、X軸をクリックしてHoechst Redを選択し、Y軸をクリックしてHoechst Blueを選択します。プロットを右クリックし、ドロップダウンメニューからプロパティを選択します。
x軸とy軸の両方に線形形式を選択し、サイドポピュレーションセルのゲートを描画します。355ナノメートルと405ナノメートルのレーザーを同時に使用して、制御細胞と実験細胞の両方を検出します。2つのレーザーに対応する690 x 50および450 x 50ナノメートルのチャネルで蛍光シグナルを取得します。
355ナノメートルおよび405ナノメートルレーザーによるHoechst 33342色素の効果的な刺激を観察し、クリアサイドの集団細胞を可視化します。同じサンプルで、細胞検出には375ナノメートルと405ナノメートルのレーザーを使用します。355ナノメートルのレーザーは、Hoechst 33342色素を効果的に励起し、骨髄のSP細胞を鮮明に観察することができました。
355ナノメートルレーザーと405ナノメートルレーザーで検出した同じ試料のSP細胞は、基本的に同一であることがわかりました。375ナノメートルと405ナノメートルの両方のレーザーがHoechst 33342を効果的に励起し、SP細胞を取得しました。
