現在のザイモグラフィー技術は、限られた数のプロテアーゼを検出します。蛍光ペプチドのザイモグラフィは、分解性基質として蛍光ペプチドを使用し、より広範なプロテアーゼの測定を可能にする。この方法の主な利点は、モジュール設計です。
蛍光ペプチドの配列は、どのプロテアーゼが検出されるかを決定し、蛍光ペプチドは、異なる配列のペプチドと容易に交換することができ、他のプロテアーゼを検出する能力である。この技術は、薬物送達や組織工学の用途に使用されるような工学的生体材料における分解性クロスリンカーとしてのペプチドの使用の設計を知らせるのに役立ちます。このペプチドをこの技術に組み込むことで、生体材料分解の原因となる組織分泌プロテアーゼを同定することができる。
この手法のデモンストレーションは、他の zymography 技術と比べてユニークな多層アプローチを視覚化するために重要です。この技術を実証する、アメヤ・デシュムク、私の研究室の大学院生。まず、テキストプロトコルの表1に概説されているように、10%ポリアクリルアミド分解ゲル溶液を調製する。
ゲルを流す直前に、TEMED と APS を加えます。次いで、溶解ゲル溶液で1.5ミリメートルミニゲルカセットを半分に充填し、空にします。ポリアクリルアミドゲルの上部にイソプロパノールの薄い層を加えて、レベルのゲルを生成し、気泡を防ぎます。
残ったポリアクリルアミド溶液を使用して、重合反応の進行を追跡します。チューブ中のポリアクリルアミドが完全に固まった場合、反応は完了する。最初の解決ゲル層が重合している間、Azido-PEG3-マレイミドキットを摂氏20度で貯蔵して、成分が室温に達することを可能にする。
次に、DMSOのメーカー推奨容量にバイアル2の成分を溶解する。そして、液体が十分に混合されていることを確認するために30秒間渦。バイアル1の内容物を、攪拌バーを含む清潔で乾燥した100ミリルローターラウンドボトムフラスコに移します。
すぐにフラスコの口に注射器で穿刺することができる横隔膜とゴム中隔栓を挿入します。次に、2本の18ゲージ注射針をダイヤフラムに挿入します。注射針の1本を不活性ガスタンクに接続し、ガスが丸底フラスコを3分間満たします。
次に、不活性ガスを遮断し、針から取り外します。注射器を使用して、フラスコにバイアル2の完全な内容物を注入する。針と注射器の両方を取り除きます。
攪拌しながら、室温で30分間混合させておきます。この後、ゴム中隔栓を取り外し、内容物を清潔な5ミリリットル遠心管に移します。最初の溶解ゲル層が重合したらイソプロパノール層を流し出す。
ゲルの上に1ミリリットルの脱イオン水をピレットし、水を注いでゲルをすすきます。チオール機能化蛍光ペプチドを摂氏80度で貯蔵から取り出す。室温で解凍してください。
テキストプロトコルの表1に概説されているように、Azido-PEG3-マレイミドリンカー分子と蛍光ペプチドを含む10%リゾルバゲル溶液を調製する。ゲルを注ぐ直前に、TMEDおよびAPSを加える。次に、ゲルカセットの残りの部分の半分をペプチド解決ゲル溶液で満たします。
ポリアクリルアミドゲルの上部にイソプロパノールの薄い層を加えて、レベルのゲルを生成し、気泡を防ぎます。残ったポリアクリルアミド溶液を使用して、重合反応の進行を追跡します。反応が完了したら、イソプロパノール層を流し落とします。
ゲルの上に1ミリリットルの脱イオン水をピレットし、水を注いでゲルをすすきます。ゲルをすぐに使用しない場合は、摂氏4度で1x PBSの100ミリリットルで満たされたプラスチック製の箱に浸して保管してください。ボックスをアルミホイルで包み、光の漂白を防ぎます。
まず、テキストプロトコルの表1に示すように、5%スタックゲル溶液を調製します。ゲルを注ぐ直前に、TMEDおよびAPSを加える。ゲルカセットの残りの空部をスタッキングゲル溶液で満たします。
1.5ミリメートルのゲルコームを積み重ねゲル層に素早く挿入し、泡が井戸の下に閉じ込められたままであることを確認します。残ったポリアクリルアミド溶液を使用して、重合反応の進行を追跡します。反応が完了したら、ジェルカセットの背面からくしとテープをそっと取り出します。
まず、従来のザイモグラフィーサンプルバッファーにサンプルを溶解する。400ミリリットルos 1XトリスグリセンスSDSランニングバッファをゲル装置に加えます。1ウェルあたり最大35マイクロリットルのサンプルをロードします。
1時間半、または分子量基準がペプチド溶解ゲル層内に含まれるプロテアーゼであることを示すまで、摂氏4度で120ボルトでサンプルを実行します。この後、プラスチックカセットからゲルを取り除きます。穏やかな攪拌の下で室温で再成間バッファーでゲルを3回洗浄します。
各洗浄で、10分間持続します。ゲルを現像バッファー溶液に 15 分間転送します。その後、新鮮な現像バッファーに溶液を交換し、24時間穏やかな攪拌の下で摂氏37度でインキュベートします。
この後、適切な励起フィルターと発光フィルターを備えた蛍光ゲルスキャナーイメージャーを使用して、ゲルをイメージします。本研究では、蛍光プロテアーゼ分解性ペプチドをポリアクリルアミドゲルに組み込む。QGIWは細胞性コラーゲンの検出を目的としたコラーゲン1種の誘導配列で、LACWはMMP-14およびMMP-11の検出に最適化された配列です。
蛍光イメージングは、LACWペプチドゲル内の多数のバンドを明らかにします, QGIWゲルでは単一のバンドのみが見られますが.ゼラチンのザイモグラフィーと比較すると、LACWゲルはより多くのタンパク質分解バンドを検出することができ、これはネイティブ基質を使用する従来の方法よりも生物学的サンプル内に存在するより広い範囲のプロテアーゼを検出するペプチドのzymographyの能力を示す。次いで、ペプチドザイモグラフィ細胞は、広いスペクトルMMP阻害剤であるGM6001、または一般的なカテプシン阻害剤であるE64のいずれかを含む開発バッファーにインキュベートされる。
GM6001によるLACWペプチドゲルの処理は、バンドの強度を低下させる。E64による治療は識別可能な効果を持っていませんが。GM6001によるQGIQペプチドゲルの処理は、以前に見られたバンドの完全なアブレーションをもたらします。
E64は効果がありませんが。ゼラチンザイモグラフィは、精製された活性化MMP-9を用いて行われ、ペプチドザイモグラフィの感度を現在の金本規格と比較する。LACWゲルはMMP-9の最小濃度を検出することができる。
プロテアーゼは、再性質と活性化するために特定の条件を必要とします。バッファー溶液を慎重に準備して、組成とPHが正しいことを確認します。この方法は、同一性を検証し、測定されたプロテアーゼのさらなる分析を行う既存の技術によって補完することができる。
これには、ウェスタンブロッティング、リアルタイム PCR、質量分析が含まれます。ポリアクリルアミドを取り扱う際は注意してください。非重合溶液は強力な神経毒と考えられ、適切な個人保護具は、それを取り扱うときに常に着用する必要があります.
