細胞培養における脳の解離と皮質ニューロンの播種

まず、分離された脳を50ミリリットルの円錐形チューブで細かく刻み、滅菌済みの使い捨てメスの刃で細かく刻みます。0.25%の最終濃度でチューブにトリプシンを加えます35〜38°Cの温水浴にチューブを15分間浸します。組織懸濁液をゆっくりと上下にピペットで動かし、細胞を解離します。

次に、0.5ミリリットルのウシ胎児血清を均質化された懸濁液に加えて、トリプシン活性を中和します。70μmのナイロンメッシュセルストレーナーで細胞懸濁液をろ過します。1ミリリットルのシリンジプランジャーを使用して、組織を細胞ストレーナーに優しく粉砕します。

次に、円錐形チューブを300 gで摂氏4度で5分間遠心分離します。T25フラスコのポリ-L-オルニチンを捨て、5ミリリットルのPBSでフラスコを3回すすいでください。チューブを慎重にデカントして上清を取り除き、2〜3ミリリットルの完全神経基礎培地を静かにピペッティングして細胞ペレットを再懸濁します。

Poly-L-オルニチンでコーティングされたT25フラスコの細胞に、5ミリリットルの完全神経基礎培地にフラスコあたり約2,000万個の細胞をプレートします。細胞培養物を5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度でインキュベートします。T25フラスコと96ウェルプレートのニューロンは、3日目までに付着して神経突起を形成しました。

最適でないニューロン培養物には、細胞の塊や破片が含まれていました。