感染前に、ミリリットルあたりの既知のコロニー形成単位の緑膿菌感染ストックを準備することから始めます。感染ストックをペレット化するには、室温で5分間10, 000 x gで遠心分離します。ペレットをPBSに再懸濁します。
次に、滅菌蒸留水、エタノール、または滅菌PBSのいずれかを含む3本の1ミリリットルマイクロフュージチューブを準備します。滅菌済みの100マイクロリットルのハミルトンシリンジを検査し、針先が鋭利で、感染部位に重大な外傷を引き起こす可能性のあるフックが発生していないことを確認します。次に、感染する前にシリンジを蒸留水、エタノール、PBSで順番に洗浄し、最大容量を引き出して廃棄します。
次に、再懸濁した感染接種物をボルテックスし、幼虫1人あたり10マイクロリットルを注入するのに十分な最大100マイクロリットルをハミルトンシリンジに引き込みます。その後、各ガレリアメロネラの幼虫に、右後部の前脚に10マイクロリットルの接種物を注入します。感染した幼虫を摂氏20度から摂氏42度の間でインキュベートします。これは、ガレリアメロネラの生存に適した範囲です。
in vitro毒性データに基づいて、抗菌剤の予想される治療範囲を超える幅広い用量を調製します。.健康で無菌のGalleria mellonellaを、さまざまな抗菌剤とPBSビヒクル濃度で適切なグループサイズで注入します。.Galleria mellonellaの細菌感染の治療を最適化するには、予備毒性試験に基づいて適切な範囲の抗菌剤用量を準備します。.
感染後2時間で、前述のように幼虫のグループに細菌を感染させます。調製した抗菌剤またはビヒクル制御溶液で幼虫を治療します。Galleria mellonellaの生存を、通常最初に死亡率が観察される時点から30分間隔またはそれ以上の頻度で監視します。
死んだ幼虫をすべて取り除き、死亡時刻を記録します。治療のタイミングが死亡率にどのように影響するかを比較するには、感染後2時間、4時間、6時間、9時間、または12時間で幼虫を治療し、30分間隔で生存を監視します。トブラマイシンの有効用量は株によって異なりました。.
PAO1には5ミリグラム/キログラム、PAKには1キログラムあたり14.2.5ミリグラム、IST27ムコイドには1キログラムあたり10ミリグラムが最適でした。LESB58に有効な用量はありませんでした。.感染後2時間、4時間、6時間後にトブラマイシン1キログラムあたり5ミリグラムで治療した結果、緑膿原虫に感染したガレリア・メロネラ幼虫の生存率は50%を超えました。
