まず、トリグリシン溶液を摂氏60度でインキュベートします。3本のRPAペレットストリップチューブを冷凍庫から取り出します。ストリップチューブをラボベンチにそっと軽くたたいて、白いペレットを取り除きます。
3つのペレットすべてを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、A.ピペット25マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に移して、ストリップチューブに残っているRPA粉末をすすぎます。すすぎ液を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移しますB.次に、0.57モルのトリグリシン溶液10マイクロリットルとプライマーミックスの10マイクロリットルをマスターミックスチューブB.チューブをボルテックスして回転させた後、氷の上に置きます。次に、5倍のRPAバッファーの28.4マイクロリットルをマスターミックスチューブB.強く叩くか複数回振とうして完全に混合します。
チューブAに集めたペレットをマスターミックスチューブBに移し、チューブを反転させるか、チューブの底を指で数回軽くたたいて混合します。溶液が均一で単相に見えるかどうかを観察します。チューブを氷の上に置きます。
次に、0.71マイクロリットルの逆転写酵素と2.84マイクロリットルのRNase Hをマスターミックスチューブに加えます。マスターミックスチューブを何度も軽くたたいたり、上下に動かしたりします。チューブを氷の上に置く前に、チューブを少し回転させます。
次に、マスターミックス溶液の8.4マイクロリットルを予冷した1.5ミリリットルのチューブ10本に分注し、チューブを氷の上に置きます。分注後、チューブを液体窒素に浸した金属製のラックに入れて、凍結乾燥の準備をします。凍結乾燥機で、コレクターと棚の温度を確認します。
次に、金属製のラックの開いたチューブをクリーニングホワイトペーパーで覆います。金属製のラックと開いたチューブを凍結乾燥機の棚に置き、棚のドアを閉じます。次に、目的のプログラムを選択して、[開始]を押します。
二次乾燥ステップの30分後、停止を押します。真空解除バルブを開いて圧力を解放します。ラックを棚から取り外した後、すぐにチューブにキャップをします。
