私たちのプロトコルは、タイプ2およびタイプ5のCRISPR dCasシステムと対応する抗CRISPRタンパク質を利用する酵母遺伝子デジタル回路を設計、構築、および分析する方法を説明しています。サービスで合成転写ネットワークを組み立ててテストするための標準的な手順がゼロであるため、アセンブリステイです。まず、20〜40ナノグラムのDNAテンプレート、1マイクロリットルのフォワードプライマー、1マイクロリットルのリバースプライマー、5マイクロリットルのDNTPミックス、0.5マイクロリットルのDNAポリメラーゼ、10マイクロリットルの5x DNAポリメラーゼ反応バッファー、および総容量50マイクロリットルまでの二重蒸留水を含む反応混合物を調製します。
原稿に記載されているように、サーモサイクラーのタッチダウンPCRプログラムを使用してDNA配列を増幅します。ゲル電気泳動でPCR産物を単離し、DNAゲル抽出キットを介してアガロースゲルからDNA配列を希釈します。ギブソンアセンブリ法を使用して、等モルのDNA混合物を摂氏50度で1時間入れることにより、精製されたPCR産物をカットオープンシャトルベクターに挿入します。
前に示したように、タッチダウンPCRとギブソンアセンブリ法を介してdCas12aアクセプターベクターを構築します。酵母コドンに最適化されたdCas12aタンパク質を、BamH1およびXhol1による消化およびT4 DNAリガーゼによるライゲーションを介して、新しく構築された2つのアクセプターベクターに挿入します。同様に、pRS2403シャトルベクターに基づいてプラスミドを構築し、タッチダウンPCRおよびギブソンアセンブリ法を介して抗CRISPRタンパク質を発現させます。
顕微鏡細胞検出を行うには、スライドガラス上に2マイクロリットルの細胞溶液を置き、カバースリップで覆います。蛍光光源、顕微鏡、コンピューターの電源を入れて、蛍光顕微鏡で細胞を観察します。蛍光灯の光源番号を書き留めたら、コンピューターで顕微鏡ソフトウェアを開きます。
スライドを顕微鏡ステージに置き、緑色の光の下で細胞を観察しながら40倍の対物レンズを選択します。酵母細胞の輪郭が現れるまでコースフォーカスノブを動かし、細かいフォーカスノブを動かして細胞の焦点を合わせます。細胞を検出するには、顕微鏡の視野を閉じた後、コンピューター画面に切り替えてライブをクリックします。
3〜5秒待ちます。キャプチャをクリックして写真を撮り、写真を保存します。次に、コンピューター、顕微鏡、蛍光灯の電源を切ります。
測定の20分前にFACSマシンのスイッチを入れてレーザーをウォームアップし、20マイクロリットルの細胞培養物を300マイクロリットルの二重蒸留水と混合します。FACS コンピューターに接続されているコンピューターで FACS ソフトウェアを実行し、新しい実験を作成します。次に、測定パラメータを設定します。
次に、サンプルの励起波長と発光波長に応じてフィルターを選択し、取得セル番号を10, 000に設定します。蛍光ビーズの強度を測定してFITCフィルター電圧を調整し、2つの連続する実験間のビーズの強度の相対差が5%を超えないようにします機械を二重蒸留水で数秒間洗浄して、余分なビーズを取り除きます。サンプルの蛍光強度を測定し、サンプル注入の安定性のために3〜5秒待っている間にプレビューをクリックします。
最後に[取得]をクリックします。実験の最後にビーズを再度測定します。2つのビーズ測定値の相対差が5%を超えるかどうかを確認した後、FACSデータをFCSファイルとしてエクスポートします。
R studioを開き、スクリプトBDverse_analysis読み込みます。R を使用して FCS ファイルを分析します。実験名を ename に設定し、FCS ファイルがdir_dとして格納され、結果ファイルがdir_rとして作成されるディレクトリ パスを設定します。
次に、蛍光チャンネルを設定します。測定されたサンプル数を設定します。ドットプロットの寸法と、棒グラフと箱ひげ図のx軸とy軸の最大長。
対応する行からハッシュタグを削除して、採点方法を選択します。選択したゲーティング方法とドットプロットの解像度(少なくとも256に等しい)に対応するgatetingされたflowSetオブジェクトを選択します。2つのフィルタリング命令のコメントを解除して、蛍光が陰性である測定値を削除し、原稿に記載されている他の実験による外れ値を削除します。
ソースを押してスクリプトを実行します。解析の結果を含むすべてのファイルがdir_rで作成されます。dSpCas9-VP64の最高の活性化効率は、合成プロモーター上に6つのlexOp標的部位がある場合に達成されました。
一方、dCas12a-VPRの場合、lexOpの3つのコピーを合成プロモーターに挿入したときに最高の活性化効率が得られます。組込みプラスミド上に位置するCRISPR RNAおよびシングルガイドRNAによる活性化は、エピソームプラスミド上に配置した場合よりも1.4〜2.4倍および1.1〜1.5倍高かった。RT-qPCRの結果は、エピソーマルベクターが、発現系に関係なく、統合ベクターよりもはるかに高いレベルのシングルガイドRNA CRISPR RNAを産生することを示しました。
MCP-VP64をリクルートする複合体dSpCas9およびスキャフォールドRNAの活性化効率を試験した。単一の野生型とF6MS2ヘアピンを含む足場RNAは、それぞれ5.27倍と4.3倍の活性化を与えました。ただし、2つのヘアピンの組み合わせにより、7.54倍になり、最高の活性化効率が得られました。
4つの異なるプロモーターを使用して、3種類のタイプ2抗CRISPRの発現を促進し、それらが用量依存的に機能することを示しました。強力なプロモーターは、蛍光レベルをその値のそれぞれ0.21、0.11、および0.13に低下させました。滴定曲線は、回路がオンとオフの比率が2.3に近い結び目の歩行のように動作することを示しています。
5型抗CRISPR A 1種は、活性化剤としてのdenAS-Cas12aとdLB-Cas12aの両方の蛍光発現を19%から71%に減少させるアクチベーターとリプレッサーの関係を調べ、Acr-VAはpTEF1下でpGAL1によって産生された場合、その性能に大きな変動を示し、遺伝的CYC1t-pCYC1noTata型5型抗CRISPR-A1は、裸のdLB Cas12aでのみいくらかの抑制を示しました。FACSマシンは壊れやすいため、慎重に取り扱う必要があります。セル溶液は密度が高すぎないようにし、機械を清潔に保つ必要があります。
